Вступ
В Україні кожного року 2,5–3 тис. потерпілих отримують травми периферичних нервів (ПН). Ступінь інвалідизації пацієнтів становить 65–70 % [1]. Вогнепальні й мінно-вибухові ушкодження кінцівок переважають у структурі бойової травми, становлячи в сучасних умовах проведення бойових дій до 75 %, у тому числі майже 80 % ушкоджень отримуються внаслідок дії вибухових боєприпасів. Досвід сучасних війн показав, що кількість поранених з ушкодженням периферичних нервів кінцівок може становити до 25 % [2, 3]. Актуальність лікування пацієнтів з ушкодженнями ПН набула особливого значення з 24 лютого 2022 року, коли відбулося повномасштабне вторгнення рф в Україну.
ПН мають властивість регенерувати, але навіть за оптимальних умов відновлення ніколи не буває повним [4]. На ступінь регенерації ПН впливає низка чинників, такі як тяжкість травми, наявність супутніх ушкоджень і захворювань, час, який минув з моменту травми до операції, відстань від місця ушкодження ПН до м’яза-ефектора і зміни в мотонейронах спинного мозку, вік пацієнта [5].
Після перетину нерва аксони, які втрачають зв’язок з тілом нейрона, піддаються валлерівській дегенерації. Навіть після виконання мікрохірургічного шва нерва явища дегенерації тривають, і аксонам треба проростати вздовж усього дистального кінця ушкодженого нерва, фактично по сполучнотканинному матриксу, роль якого виконує дистальна кукса нерва. Після завершення дегенеративних процесів починаються процеси регенерації. Шваннівські клітини утворюють тяжі в напрямку від проксимального кінця нерва до дистального, проростають ділянку шва нерва аж до органа-мішені [6].
Час, протягом якого відбувається проростання нервових волокон, має критичне значення, тому що денервація м’яза, навіть після негайного відновлення цілісності нерва, призводить до втрати 65 % функціонального потенціалу м’яза. У випадку хронічної денервації м’яза втрата функціонального потенціалу зменшується до 10 %. Іншим фактором є кількість шваннівських клітин і їх здатність мігрувати з проксимального кінця ушкодженого нерва до дистального і брати участь у реіннервації м’яза [7].
Одним з найперспективніших методів стимуляції регенерації ПН є електростимуляція (ЕС). Після реконструкції нерва короткотривала ЕС приводить до зміни трансмембранного потенціалу, через який активується внутрішньоклітинний механізм регенерації ПН. Існує теорія про те, що ЕС підсилює експресію генів, відповідальних за регенерацію ПН [8].
Ще одним фактором, який підсилює регенерацію, є стимуляція утилізації мієлін-асоційованого глікопротеїну і протеогліканів, які утворюються внаслідок валлерівської дегенерації і затримують регенерацію ПН, шляхом зростання концентрації цАМФ [9].
Після травми ПН і мікрохірургічної реконструкції аксони регенерують у випадковій послідовності, і не завжди відповідно до попередньої гістоархітектоніки, коли проростають з проксимальної кукси ПН у дистальну. Результатом такого процесу є неефективна реіннервація м’яза-ефектора, що призводить до його атрофії та поганого функціонального відновлення [10].
У доклінічних моделях застосування ЕС прискорювала час регенерації мотонейронів до 3 тижнів порівняно з 8–10 тижнями без ЕС, крім того, використання даної методики приводило до подвоєння кількості регенеруючих сенсорних аксонів [11].
Після часткового ушкодження ПН м’язи-ефектори продукують хемоатрактанти, які стимулюють проростання аксонів із проксимального кінця нерва. Експериментально доведено, що у випадку повного ушкодження, коли зв’язок між нервом і м’язом повністю втрачений, ЕС дозволяє збільшити концентрацію хемоатрактантів у дистальному кінці нерва для стимуляції селективного проростання моторних аксонів навіть за відсутності прямого зв’язку з м’язом [12].
Мета: визначити вплив довготривалої інвазивної електростимуляції на функціональне відновлення нервово-м’язового апарату в експерименті.
Матеріали та методи
Дослідження виконано на 29 білих безпородних кролях (2500 ± 250 г, 5–6 міс.), які утримувалися в стандартних умовах віварію ДУ «Інститут нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова НАМН України» з дотриманням чинних норм біоетики (Директива Ради ЄС 86/609/ЕЕС «Про наближення законів, підзаконних та адміністративних положень держав-членів про захист тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» (1986), Європейська конвенція про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та наукових цілей (1986), Закон України № 3447-IV «Про захист тварин від жорстокого поводження» (2006)). Протокол дослідження схвалено Комітетом з біоетики Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця. Робота виконана в рамках договору про науково-методичну співпрацю між ДУ «Інститут нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова НАМН України» і Національним медичним університетом ім. О.О. Богомольця.
Усі хірургічні втручання виконувалися під загальним знеболюванням (внутрішньом’язова ін’єкція) розчинами кетаміну гідрохлориду 10% (50 мг/кг), ксилазину гідрохлориду 2% (5 мг/кг) та атропіну сульфату (0,05 мг/кг), виконували доступ до сідничного нерва (СН) у кроля.
Для імплантації використовувалася електростимулююча система (ЕСС), яка частково імплантується, «НейСі3-М» вітчизняного виробництва (ТОВ «ВЕЛ»), дозволена для клінічного використання.
Тварину фіксували на операційному столі. Дотримуючись правил асептики й антисептики, після гоління операційного поля та його обробки розчинами антисептиків виконувався лінійний розріз шкіри по латеральній поверхні стегна в проєкції СН справа. За допомогою інструментів (затискач типу «москіт», пінцет хірургічний) тупо-гостро виділявся й мобілізувався правий СН (рис. 1).
Усі тварини розподілялися на такі експериментальні групи.
Група 1 (n = 8). Контрольна група. Шов сідничного нерва й імплантація неробочої антени електростимулюючого пристрою.
У середній третині стегна попередньо мобілізований сідничний нерв перетинали лезом скальпеля і виконували негайний епіневральний шов «кінець у кінець» (5–6 швів) з використанням атравматичного шовного матеріалу (поліамід 8,0), мікроінструментів і збільшувальної оптики (операційний мікроскоп, збільшення × 12). Після виконання шва СН у підшкірній клітковині формували кишеню, у яку поміщали приймаючу антену ЕСС, електроди від якої підшивали до епіневрію з використанням атравматичного шовного матеріалу 10,0 і мікрохірургічної техніки (одна пара електродів проксимальніше та інша пара — дистальніше від місця шва СН). Пошарові шви на м’язи й шкіру. Зупинка кровотечі під час операції за допомого турунд, змочених H2O2. Електростимуляція цій групі тварин не проводилась (рис. 1, А-С).
У групі 2 (n = 7): аналогічна операція епіневрального шва СН з імплантацією антени електростимулятора і початок стимуляції на 2-гу добу після операції.
У групі 3 (n = 7): аналогічна операція епіневрального шва СН з імплантацією антени електростимулятора і початок стимуляції через 3 тижні, коли спостерігали початкові ознаки регенерації нерва.
Визначення початкових ознак регенерації нерва проводили за методикою toe spreading reflex [13]. Початкові ознаки регенерації фіксувалися за наявності першого ступеня реакції за шкалою Schmitz і Beer (ледь помітне розгинання одного з пальців експериментальної кінцівки).
У групі 4 (n = 7): автонейропластика сідничного нерва + імплантація електростимулятора і початок стимуляції в часовій точці, яка збігається з початком ознак реіннервації м’язів-ефекторів. Автонейропластика моделювалася шляхом висікання фрагмента сідничного нерва кроля завдовжки 1 см поворотом його на 180° і підшиванням 4–5 епіневральними швами на обох кінцях за допомого мікрохірургічної техніки (рис. 1D). Початкові ознаки регенерації визначалися як у групі 2 і фіксувалися через 3 тижні.
У групі 5 (n = 6): невротизація + імплантація електростимулятора і початок стимуляції в часовій точці, яка збігається з початком ознак реіннервації м’язів-ефекторів. Невротизацію моделювали шляхом перетину малогомілкового і великогомілкового нервів і перехресного шва проксимальної кукси великогомілкового нерва з дистальною куксою малогомілкового нерва і, навпаки, проксимальної кукси малогомілкового нерва з дистальною куксою великогомілкового нерва (рис. 1E, 1F).
Після ретельного гемостазу в усіх групах тварин пошарове зашивання післяопераційної рани проводилося за допомогою сертифікованої атравматичної голки з монофіламентною поліамідною ниткою 4/0.
З метою запобігання інфекційним ускладненням у задню шийну ділянку підшкірно вводили розчин бензилпеніциліну в дозі 1 млн од. на 1 кг маси тіла. З метою протизапальної і протинабрякової терапії внутрішньом’язово вводили розчин дексаметазону в дозі 6 мг/кг маси тіла. Після хірургічного втручання дослідні тварини утримувались у стандартних умовах, отримували однакове харчування згідно з нормами віварію.
Використовувався режим електростимуляції зі змінною частотою імпульсів за циклом: половина періоду Т — генерація імпульсів, половина періоду Т — відсутність імпульсу в діапазоні, Т — від 0,5 до 15 с, мінімальна частота — 2 Гц, максимальна частота — 120 Гц, і з фіксованою частотою 20 і 80 Гц. Амплітуда імпульсів у всіх режимах при опорі навантаження 10 кОм була від 8 до 20 В. Сеанси електростимуляції тривалістю 5 хв на день проводили кожного дня.
Електронейроміографію (ЕНМГ) виконували у тварин усіх експериментальних груп через 12 тижнів після операції. Після наркотизації тварин шляхом внутрішньом’язової ін’єкції розчинів кетаміну гідрохлориду 10% (50 мг/кг), ксилазину гідрохлориду 2% (5 мг/кг) та атропіну сульфату (0,05 мг/кг) і фіксації на операційному столі виконували доступ до сідничного нерва в кроля. Уздовж хвоста фіксували електрод заземлення (металізована стрічка, змочена 0,9% розчином натрію хлориду, шириною 20 мм, довжиною 100 мм), за допомогою мікрохірургічної методики виділяли СН від місця виходу з малого таза до розподілу його на гілки на правій (експериментальній) і лівій (інтактній) задніх кінцівках. Для проведення ЕНМГ використовували платиновий гачкоподібний біполярний електрод (діаметр монополяра — 0,22 мм, відстань між монополярами — 5,5 мм). Стимулюючий струм генерували цифровим електронейроміографом «Нейро-МВП-Мікро» (ТОВ «Нейрософт»), подавали в імпульсному режимі (тривалість імпульсу — 5 мс) із частотою 0,2 Гц (1 імпульс на 5 с) і кроком збільшення сили струму в 1 мА. Інтенсивність стимуляції підбиралася індивідуально, виходячи з того рівня, при якому досягали максимальної амплітуди М-відповіді (Амв), і становила в середньому 2,5 ± 0,5 мА (3,0 ± 0,5 мВ). Реєстрацію збудження проводили вказаним електронейроміографом за допомогою концентричного голкового електрода (довжина — 25 мм, діаметр — 0,3 мм, площа відведення — 0,015 мм2) у руховій точці литкового м’яза. Відстань між стимулюючим і реєструючим електродами становила близько 80 мм. Після проведення дослідження тварину у стані наркотичного сну виводили з експерименту шляхом ін’єкції летальної дози препаратів для наркозу.
Аналіз функції нервово-м’язового апарату лабораторних тварин здійснювали на підставі амплітуди М-відповіді — показник амплітуди потенціалу дії максимального скорочення м’яза на пряму стимуляцію нерва, який іннервує цей м’яз (у мкВ), і латентного періоду М-відповіді (ЛПмв) — період від моменту стимуляції нерва до моменту реєстрації потенціалу дії м’яза (у мс). Швидкість проведення імпульсу є невірогідною при такій малій відстані між стимулюючим і реєструючим електродами в експериментальних тварин (близько 8 см), тому для порівняння використовували вищенаведені показники. Фіксували показники амплітуди максимальної М-відповіді, отримані в більшості випадків при силі стимулюючого струму 3 мА.
Статистичну обробку цифрових даних здійснювали за допомогою програмного пакета Statistica 10.0 на персональному комп’ютері. Усереднені величини подавали у вигляді (М ± m), де М — середнє значення величини, m — стандартна похибка середнього значення величини. Вірогідність різниці між групами розраховували за U-тестом Манна — Уїтні (Mann-Whitney U-test). У всіх випадках припущення щодо статистичної значущості отриманого результату вважали вірним, якщо ймовірність нульової гіпотези була меншою, ніж 0,01 (р < 0,01).
Результати та обговорення
Регенерація ПН після травми ніколи не буває повною, і ступінь дефіциту в даній роботі виражали у відносних величинах: умовною нормою вважали ЕНМГ-показники контралатеральної кінцівки (рис. 2).
У групі 1 (група тварин, яким проводили встановлення антени ЕСС, але не стимулювали), яка була контрольною, Амв дорівнювала 3,87 ± 1,03 мВ і становила 22,95 % від норми. ЛПмв дорівнював 2,40 ± 0,43 мс і був у 1,53 раза більшим від норми. У групі 2, де тваринам після перетинання і негайного шва сідничного нерва в середній третині стегна імплантувалася антена ЕСС і стимуляцію починали на другий день після операції, спостерігали подібну динаміку процесу, проте з кращими показниками. Амв дорівнювала 4,83 ± 0,56 мВ і становила 26,8 % від норми. ЛПмв дорівнював 1,71 ± 0,18 мс і був в 1,17 раза більшим від норми. Різниця показників виявилася статистично вірогідною на користь групи 2 (для Амв р = 0,0003, для ЛПмв р = 0,002) (рис. 2). Тобто безпосередня електростимуляція ПН приводить до поліпшення амплітуди М-відповіді, що опосередковано свідчить про більшу кількість аксонів, які досягли м’яза впродовж 8 тижнів.
У групі 3, де виконували шов нерва з імплантацією антени ЕСС за тих же умов, що й у групі 2, але стимуляцію починали з появою перших ознак регенерації, показники були дещо нижчі, ніж у групі 2. Амв дорівнювала 3,29 ± 0,42 мВ і становила 20,52 % від норми. ЛПмв дорівнював 2,26 ± 0,31 мс і був у 2,03 раза більшим від норми (рис 2). При порівнянні показників Амв і ЛПмв групи 2 і групи 3 різниця була статистично вірогідною (р = 0,0056 і р = 0,0032 відповідно).
При порівнянні груп 1 і 3 кращі показники як для Амв, так і для ЛПмв отримані в групі 3. Різниця була статистично вірогідною (р = 0,002 для Амв і р = 0,007 для ЛПмв).
У групі 4, де виконували автопластику сідничного нерва й імплантували антену ЕСС, а електростимуляцію починали при появі перших ознак регенерації ПН, Амв дорівнювала 1,49 ± 0,34мВ і становила 8,45 % від норми. ЛПмв дорівнював 2,5 ± 0,64мс і був у 2,1 раза вище від норми.
При порівнянні Амв у групі 1 і групі 4 різниця виявилася статистично вірогідною на користь групи 1 (р = 0,0002), однак різниця ЛПмв виявилася статистично невірогідною (р = 0,056).
Це дозволяє зробити припущення, що електростимуляція ПН підвищує швидкість росту аксонів та опосередковано покращує мієлінізацію нервових волокон за умови меншого впливу на абсолютну кількість аксонів, що проростають у напрямку м’яза.
У групі 5, де моделювалася операція невротизації з імплантацією антени ЕСС і початком електростимуляції при появі перших ознак регенерації, отримані ще нижчі показники відновлення. Амв дорівнювала 1,20 ± 0,15 мВ і становила 7,3 % від норми. ЛПмв дорівнював 2,76 ± 0,48 мс і був у 2,31 раза вище від норми.
При порівнянні показників у групі 1 і групі 5 вищі показники виявилися у групі 1, і різниця була статистично вірогідною (р = 0,0083 для Амв і р = 0,0001 для ЛПмв).
Аналогічні дані отримані при порівнянні групи 2 і групи 5, статистично значуща різниця була на користь групи 2 (р = 0,0034 для Амв і р = 0,0005 для ЛПмв). У групі 5 процес регенерації ускладнюється через збільшення ролі процесів нейропластичності на рівні центральної нервової системи, які не були предметом вивчення в даному дослідженні.
При порівнянні групи 3 і групи 5 статистично значуща різниця в показниках була на користь групи 3 (р = 0,0043 для Амв і р = 0,0006 для ЛПмв).
Проте при порівнянні групи 4 і групи 5 при кращих показниках у групі 4 різниця між ними виявилася статистично невірогідною (р = 0,035 для Амв і р = 0,04 для ЛПмв).
Статистично вірогідна різниця спостерігалася при порівнянні групи 2 і групи 4 на користь групи 2 (р = 0,004 для Амв і р = 0,0083 для ЛПмв). Такі результати дають можливість зробити припущення, що за умов автопластики початок стимуляції не дає значущого ефекту в періоді, коли «авангардні» нервові волокна, які формують конус росту, вже досягли м’яза.
При порівнянні групи 3 і групи 4 статистично вірогідна різниця отримана на користь показників групи 3 (р = 0,0004 для Амв і р = 0,006 для ЛПмв).
Отже, у групі 2, у якій електростимуляцію починали на наступний день після операції, показники функціонального відновлення нервово-м’язового апарату були кращими, ніж за її відсутності, а також за умов початку стимуляції в періоді, коли спостерігали початкові ознаки регенерації. Тому можна зробити припущення, що інвазивна електростимуляція периферичного нерва, розпочата в гострому періоді після травми, позитивно впливає на регенерацію ПН, а також на результати функціонального відновлення нервово-м’язового апарату. Про позитивний вплив ЕС на функціональний стан м’язів опосередковано свідчить більша амплітуда М-відповіді в групі, де стимуляцію починали швидше. Більша амплітуда М-відповіді протягом часу спостереження говорить про більшу кількість аксонів, які досягли м’яза впродовж 8 тижнів. Беручи до уваги, що конус росту регенеруючого нерва містить певну кількість аксонів, які проростають до органа-ефектора, в даному випадку м’яза, першими, при відносно незмінній латенції потенціалу дії можна припустити, що безпосередня електростимуляція ПН приводить до збільшення швидкості проростання аксонів при їх відносно незмінній кількості. Відсутність вірогідної різниці латенції потенціалу дії в групах, де виконувалася автопластика і шов, при однакових умовах стимуляції свідчить про позитивний вплив стимуляції на мієлінізацію нервових волокон.
Краща М-відповідь опосередковано свідчить про задовільний функціональний стан м’яза, що в умовах денервації дозволяє зберегти його потенціал для відновлення, запобігти атрофії.
Висновки
Підсумовуючи все вищенаведене, опосередковано, за даними електрофізіологічного дослідження, можна зробити такі висновки:
1) вплив інвазивної електростимуляції на регенерацію нервово-м’язового апарату є позитивним і супроводжується кращим ефектом, якщо вона проводиться в ранні терміни після травми;
2) інвазивна електростимуляція периферичного нерва є процедурою, яка дозволяє прискорити ріст нервових волокон, покращити їх мієлінізацію і запобігти втраті функціональної спроможності денервованого м’яза.
Конфлікт інтересів. Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів і власної фінансової зацікавленості при підготовці даної статті.
Внесок авторів. Петрів Т.І. — концепція і дизайн дослідження, моделювання травми ПН, інтерпретація отриманих результатів, написання тексту та редагування; Рафт Мохаммад Дауд Альмхайрат — моделювання травми ПН, виконання ЕНМГ, інтерпретація отриманих результатів, написання тексту та редагування; Татарчук М.М. — виконання ЕНМГ; Лузан Б.М. — концепція і дизайн дослідження, інтерпретація отриманих результатів; Цимбалюк Ю.В. — концепція і дизайн дослідження; Цимбалюк В.І. — концепція і дизайн дослідження, інтерпретація отриманих результатів.
Отримано/Received 30.03.2023
Рецензовано/Revised 17.04.2023
Прийнято до друку/Accepted 20.04.2023
Список литературы
1. Цимбалюк В.І., Чеботарьова Л.Л., Дубина Г.І. Електрофізіологічна діагностика закритого травматичного ураження плечового сплетення, поєднаного з черепно-мозковою травмою. Український нейрохірургічний журнал. 2004. № 4. С. 65-68.
2. Strafun S.S., Shypunov V.H., Laksha A.M., Borzykh N.O., Tsymbaliuk Ya.V., Sydorova N.M. Assessment of subfascial pressure changes in injured with polystructural gunshot wounds to the lower extremity. World of Medicine and Biology. 2022. № 3(81). Р. 188-192. doi: 10.26724/2079-8334-2022-3-81-188-192.
3. Tsymbaliuk V.I., Kuchyn Yu.L., Lurin I.A., Strafun S.S., Graboviy O.M., Gumenyuk K.V., Tsymbaliuk Ia.V. Study of gunshot injuries features of peripheral nerves by modern weapons in the experiment. World of Medicine and Biology. 2022. № 3(81). P. 242-247. doi: 10.26724/2079-8334-2022-3-81-242-247.
4. Wang M.L., Rivlin M., Graham J.G., Beredjiklian P.K. Peri-pheral nerve injury, scarring, and recovery. Connective Tissue Research. 2019. № 60(1). P. 3-9. doi: 10.1080/03008207.2018.1489381.
5. Gordon T. Peripheral Nerve Regeneration and Muscle Reinnervation. International Journal of Molecular Sciences. 2020. № 21(22). P. 8652. doi: 10.3390/ijms21228652.
6. Nocera G., Jacob C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cell Molecular Life Science. 2020. № 77(20). P. 3977-3989. doi: 10.1007/s00018-020-03516-9.
7. Robinson L.R. Predicting Recovery from Peripheral Nerve Trauma. Physical Medicine Rehabilitation Clinics of North America. 2018. № 29(4). Р. 721-733. doi: 10.1016/j.pmr.2018.06.007.
8. Senger J.L.B., Verge V.M.K., Macandili H.S.J., Olson J.L., Chan K.M., Webber C.A. Electrical stimulation as a conditioning strategy for promoting and accelerating peripheral nerve regeneration. Experimental Neurology. 2018. № 302. Р. 75-84. doi: 10.1016/j.expneurol.2017.12.013.
9. Senger J.B., Rabey K.N., Acton L., Lin Y.S., Lingrell S., Chan K.M., Webber C.A. Recovering the regenerative potential in chronically injured nerves by using conditioning electrical stimulation. Journal of Neurosurgery. 2021. Р. 1-13. doi: 10.3171/2021.4.JNS21398. Epub ahead of print. PMID: 34653977.
10. Gordon T. Electrical Stimulation to Enhance Axon Regeneration After Peripheral Nerve Injuries in Animal Models and Humans. Neurotherapeutics. 2016. № 13(2). Р. 295-310. doi: 10.1007/s13311-015-0415-1.
11. Ransom S.C., Shahrestani S., Lien B.V. et al. Translational Approaches to Electrical Stimulation for Peripheral Nerve Regeneration. Neurorehabilitation Neural Repair. 2020. № 34(11). Р. 979-985. doi: 10.1177/1545968320962508.
12. Quan X., Huang L., Yang Y. et al. Potential Mechanism of Neurite Outgrowth Enhanced by Electrical Stimulation: Involvement of MicroRNA-363-5p Targeting DCLK1 Expression in Rat. Neurochemistry Research. 2017. № 42(2). Р. 513-525. doi: 10.1007/s11064-016-2100-0.
13. Schmitz H.C., Beer G.M. The toe-spreading reflex of the rabbit revisited-functional evaluation of complete peroneal nerve lesions. Laboratory Animals. 2001. № 35(4). Р. 340-345. doi: 10.1258/0023677011911930.
/38.jpg)
/39.jpg)