Резюме
Актуальність. У наш час продовжується пошук біологічних маркерів, що мають високу специфічність та чутливість і можуть використовуватися як неінвазивні маркери для діагностики запальних захворювань кишечника (ЗЗК), зокрема диференціації виразкового коліту (ВК) і хвороби Крона (ХК), що важливо для визначення лікувальної тактики і прогнозу розвитку захворювання. Мета: визначити вміст антитіл IgA, IgG до Saccharomyces cerevisiae, перинуклеарних антинейтрофільних цитоплазматичних антитіл та їх клінічне значення у пацієнтів з виразковим колітом та хворобою Крона. Матеріали та методи. Обстежено 49 хворих на ЗЗК, які знаходились на лікуванні у відділенні захворювань кишечника ДУ «Інститут гастроентерології НАМН України». Усі хворі були розділені на дві групи: 33 хворі на ВК та 16 хворих на ХК. Крім того, хворі були поділені на групи залежно від тяжкості перебігу ВК: легкий ступінь ВК — 3 пацієнти, ВК середнього ступеня — 26 пацієнтів та 4 пацієнти — з тяжким ступенем перебігу ВК. Серед хворих на ХК було 13 пацієнтів середнього ступеня тяжкості перебігу та 3 пацієнти — з перебігом ХК тяжкого ступеня. Р-ANCA класу IgG визначали за допомогою непрямої реакції імунофлюоресценції, у сироватці крові визначали титр IgА та IgG до антитіл до Saccharomyces cerevisiae (ASCA) методом імуноферментного аналізу. Статистичну обробку результатів здійснювали за допомогою пакета прикладних програм Statistica 6.1. Результати. У більшості пацієнтів з ВК виявлялись р-ANCA, а у хворих на ХК — підвищений титр IgА та IgG до ASCA. У хворих на ХК рівень IgА та IgG до ASCA залежав від ступеня тяжкості перебігу хвороби, що підтверджувалося встановленим кореляційним зв’язком їх рівня із ступенем тяжкості хвороби (r = 0,608; р = 0,012). Проведення аналізу показало, що тест p-ANCA IgG для підтвердження діагнозу ВК має чутливість 63 % і специфічність 86 %. Тоді як наявність підвищеного рівня IgA або IgG до ASCA для діагностики ХК має чутливість 72 % і специфічність 82 %. Комбінація «p-ANCA IgG-позитивних і IgА, IgG до ASCA-негативних результатів» у пацієнтів з ВК показала чутливість і специфічність 75,6 і 68,8 % відповідно, з діагностичною точністю 68,8 %. Для комбінації «IgА, IgG до ASCA-позитивних і p-ANCA-негативних результатів» у пацієнтів з ХК чутливість становила 81,3 %, а специфічність — 80 % з діагностичною точністю 80,8 %. Тому одночасне визначення IgA, IgG до ASCA та p-ANCA IgG збільшує позитивну прогностичну точність при диференційній діагностиці ВК та ХК у пацієнтів із ЗЗК. Висновки. Встановлено, що окреме визначення показників IgА, IgG до ASCA та р-ANCA класу IgG для диференціації ВК та ХК має меншу чутливість та специфічність, натомість при об’єднанні двох тестів прогностична цінність позитивного результату та специфічність можуть бути істотно збільшені.
Background. It is important to search for biological markers with high specificity and sensitivity as a non-invasive method for accurate diagnosis of inflammatory bowel disease (IBD), in particular, differentiation of ulcerative colitis (UC) and Crohn’s disease (CD), which is important for both prognosis and treatment. The purpose of the study was to determine the titer of anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies (ASCA) IgG, IgA, perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies (p-ANCA) and their clinical significance in patients with ulcerative colitis and Crohn’s disease. Materials and methods. The study included 49 patients with IBD who were treated at the Department of Intestinal Diseases of the State Institution “Institute of Gastroenterology of the National Academy of Medical Sciences of Ukraine”. All patients were divided into two groups: 33 individuals with UC and 16 with CD. In addition, the patients were divided into groups depending on the severity of UC course: mild — 3, moderate — 26, and 4 individuals had severe UC. Among patients with CD, severity was moderate in 13 cases and severe CD was detected in 3 cases. p-ANCA IgG were determined by an indirect immunofluorescence assay. The serum level of ASCA IgA and IgG was evaluated by the enzyme-linked immunosorbent assay. The results were statistically processed using the Statistica 6.1 software package. Results. Most patients with UC appeared to have p-ANCA, and in patients with CD, an increased level of ASCA IgA and IgG was found. Among patients with CD, the level of ASCA IgA and IgG depended on the severity of the disease, which was confirmed by the revealed correlation between their level and the severity of the disease (r = 0.608; p = 0.012). Analysis showed that the p-ANCA IgG test for confirming the diagnosis of UC has a sensitivity of 63 % and a specificity of 86 %, whereas the presence of an elevated level of ASCA IgA or IgG for the diagnosis of CD has a sensitivity of 72 % and a specificity of 82 %. The combination of positive p-ANCA IgG and negative ASCA IgA, IgG in patients with UC showed a sensitivity and specificity of 75.6 and 68.8 %, respectively, with a diagnostic accuracy of 68.8 %. For combination of positive ASCA IgA, IgG and negative p-ANCA IgG in patients with CD, the sensitivity was 81.3 % and the specificity was 80 % with a diagnostic accuracy of 80.8 %. Therefore, the simultaneous determination of ASCA IgA, IgG and p-ANCA IgG increases the positive predictive accuracy in the differential diagnosis of UC and CD among patients with IBD. Conclusions. It was found that the separate assessment of ASCA IgA, IgG and p-ANCA IgG for the differentiation of UC and CD has lower sensitivity and specificity, but when the two tests are combined, the predictive value of a positive result and specificity can be significantly increased.
Вступ
Запальні захворювання кишечника (ЗЗК), що включають виразковий коліт (ВК) та хворобу Крона (ХК), являють собою неспецифічну запальну патологію, що вражає шлунково-кишковий тракт. Багатоцентрові дослідження та метааналізи продемонстрували зростаючу поширеність ЗЗК у світі [1]. Упродовж останніх років в Україні також відмічається значне підвищення показників захворюваності на ЗЗК, що пов’язано у першу чергу з поліпшенням діагностичних можливостей. У 2015 р. в Україні абсолютне число нових випадків ЗЗК становило 179, темп приросту за два роки становив 15,1 %. Вперше виявлених пацієнтів із ХК було 79 осіб, темп приросту становив 28,1 %. Найбільш високі показники поширеності ЗЗК відзначались у Вінницькій, Волинській, Рівненській, Івано-Франківській, Хмельницькій, Чернігівській, Київській області та м. Києві [2]. Патогенез ЗЗК повністю не з’ясований, але, згідно із сучасними уявленнями, визначають, що генетична сприйнятливість, порушення імунної регуляції, стан кишкової мікробіоти і тригери довкілля мають велике значення у розвитку та прогресуванні захворювань кишечника [3, 4].
Незважаючи на те, що основним методом діагностики ЗЗК є ендоскопічний, все більшої поширеності набуває використання фекальних і серологічних маркерів оцінки запального процесу в кишечнику [4]. Дослідження лабораторних маркерів дозволяє об’єктивно оцінити активність хвороби, здійснювати контроль за лікуванням, проводити диференційну діагностику. Дослідження антитіл у сироватці крові використовується для діагностики та стратифікації імуноопосередкованих захворювань протягом багатьох років [4]. Для ЗЗК характерна поява кількох типів антитіл з різною антигенною специфічністю, зокрема антимікробних антитіл та автоантитіл. Перинуклеарні антинейтрофільні цитоплазматичні антитіла (p-ANCA) та антитіла до Saccharomyces cerevisiae (ASCA) є серологічними маркерами, які вивчаються при ЗЗК. Антитіла до цитоплазми нейтрофілів є групою автоантитіл, в основному класу IgG, проти антигенів, локалізованих в азурофільних і специфічних гранулах нейтрофілів і моноцитів p-ANCA, що виявляються у 65 % хворих на ВК. Антитіла ASCA класів IgA та IgG відносяться до сімейства антигліканових антитіл, спрямовані до мананового білка дріжджів Saccharomyces cerevisiae, були виявлені в 40–70 % пацієнтів із ЗЗК. Однак роль антитіл до ASCA у патогенезі ЗЗК на сьогодні залишається все ж таки невідомою. Наявність p-ANCA пов’язують з більш несприятливим перебігом захворювання при ВК [5], а підвищення титру ASCA — з більшою кількістю ускладнень при ХК [6]. Застосування цих маркерів у клінічній практиці є важливим для підтвердження діагнозів ВК та ХК. Вивчення наявності антитіл у доклінічній фазі ЗЗК є одним із способів краще зрозуміти роль антитіл у патогенезі ЗЗК. Цей підхід використовували в деяких дослідженнях [7], і результати цих досліджень продемонстрували, що у значної кількості пацієнтів виявляють антитіла заздалегідь до встановлення діагнозу[8].
Актуальним є пошук біологічних маркерів з високою специфічністю та чутливістю як неінвазивного методу для діагностики ЗЗК, зокрема диференціації ВК і ХК, що важливо як для прогнозу розвитку захворювання, так і для призначення лікування. Це дослідження спрямоване на вивчення особливостей вмісту антитіл класу IgA, IgG до ASCA та p-ANCA класу IgG і з’ясування того, якою мірою вони пов’язані з розвитком та прогресуванням ЗЗК.
Мета роботи: визначити вміст антитіл IgA, IgG до Saccharomyces cerevisiae, перинуклеарних антинейтрофільних цитоплазматичних антитіл та їх клінічне значення у пацієнтів з виразковим колітом та хворобою Крона.
Матеріали та методи
Проведено обстеження 49 хворих на ЗЗК, які знаходилися на лікуванні у відділенні захворювань кишечника ДУ «Інститут гастроентерології НАМН України», із них 27 жінок і 22 чоловіки, середній вік становив (38,4 ± 1,5) року. Пацієнти розподілені на групи залежно від нозології: 33 із ВК, 16 із ХК. Діагноз ВК та ХК підтверджено відповідно до міжнародних стандартів з поєднанням клінічних, ендоскопічних та гістологічних досліджень. Ендоскопічні дослідження товстої кишки проводилися за загальноприйнятими методиками з використанням відеоколоноскопа Olympus EVIS EXERA III (Японія) для встановлення діагнозу ВК та ХК. Пацієнти були поділені на групи залежно від тяжкості перебігу ВК: легкий ступінь ВК — 3 пацієнти, ВК середнього ступеня — 26 пацієнтів та 4 пацієнти — з перебігом ВК тяжкого ступеня. Серед хворих на ХК було 13 пацієнтів із середнім ступенем тяжкості перебігу ХК та 3 пацієнти — з тяжким ступенем. Тяжкість перебігу захворювання визначали за індексом Мейо (Mayo Scoring System) для хворих на ВК і за індексом Беста (CDAI) — для пацієнтів із ХК.
Дослідження не суперечило положенням біоетики та було схвалено комісією з питань медичної та біологічної етики ДУ «Інститут гастроентерології НАМН України».
Матеріалом для дослідження служила венозна кров, яку забирали з ліктьової вени в об’ємі 10 мл вранці натщесерце. Р-ANCA класу IgG визначали за допомогою непрямої реакції імунофлюоресценції, яка є золотим стандартом виявлення p-ANCA. Як субстрат реакції використовували нейтрофіли, які були виділені із венозної крові людини та фіксовані за допомогою етанолу. Визначення імунофлюоресцентного світіння проводили за допомогою кролячих антитіл до IgG людини фірми AbCam, СШA. Результат вважався негативним при титрі менше за 1 : 40 [9].
Титри антитіл IgА та IgG до ASCA у сироватці крові визначали методом імуноферментного аналізу з використанням тест-систем фірми Euroimmun (Німеччина) за допомогою аналізатора Stat Fax 303 Plus (США). За фізіологічну норму приймали вміст антитіл IgА та IgG до ASCA у сироватці крові менше ніж 20 Од/мл згідно з інструкцією до набору реагентів.
Усі вихідні дані, отримані при виконанні роботи, з метою оптимізації математичної обробки вводились у базу даних, побудовану за допомогою електронних таблиць Microsoft Excel. Статистична обробка результатів досліджень здійснювалась методами варіаційної статистики, реалізованими стандартним пакетом прикладних програм Statistica for Windows 6.0. Для статистичного аналізу даних використовували дескриптивну статистику: Ме — медіана та Q1 — нижній квартиль, Q3 — верхній квартиль, порівняння середніх значень змінних здійснювали за допомогою параметричного методу (t-критерію Стьюдента) за нормального розподілу даних ознак, що виражені в інтервальній шкалі. Відповідність виду розподілу ознак закону нормального розподілу перевіряли за допомогою методу Шапіро — Уїлка. В інших випадках використовували непараметричний метод (U-критерій Манна — Уїтні). Різниця середніх значень показників вважалася вірогідною при р < 0,05. Взаємозв’язки між показниками оцінювали за допомогою значущих коефіцієнтів кореляції Спірмена (r). Оцінка діагностичного тесту проводилася шляхом побудови «латинського квадрату».
Результати та обговорення
У 42,4 % пацієнтів з ВК визначалася наявність р-ANCA класу IgG (рис. 1), у 21,2 % хворих встановлено підвищення вмісту IgА до ASCA, у 6,1 % — IgG до ASCA (табл. 1).
Водночас у 25,0 % хворих на ХК визначалось підвищення титру IgА, IgG до ASCA, у 12,5 % пацієнтів — наявність р-ANCA класу IgG. Медіана рівня IgА до ASCA вірогідно не відрізнялась між групами (табл. 1). Необхідно відмітити, що рівень IgG до ASCA був вірогідно вищий в 3,7 раза (р < 0,05) у хворих на ХК порівняно з його рівнем у хворих на ВК.
Наступним етапом нашої роботи було проведення аналізу отриманих даних залежно від тяжкості перебігу хвороби. Найбільший рівень антитіл IgА до ASCA було встановлено у хворих з легким ступенем тяжкості перебігу ВК, а саме визначено його підвищення в 9,9 раза (р < 0,05) порівняно із групою хворих на ВК середнього ступеня та в 6,6 раза (р < 0,05) порівняно із групою хворих на ВК тяжкого ступеня (рис. 2). Необхідно відзначити, що лише у хворих з перебігом ВК середнього ступеня тяжкості були виявлені р-ANCA IgG (53,8 % випадків) та підвищений рівень IgG до ASCA (7,7 % випадків).
У хворих на ХК рівень IgА, IgG до ASCA залежав від ступеня тяжкості перебігу хвороби (рис. 3), що підтверджується встановленим кореляційним зв’язком їх рівня із ступенем тяжкості ХК (r = +0,608; р = 0,012, та r = +0,611; р = 0,012 відповідно).
Таким чином, для хворих на ВК більш характерною була наявність р-ANCA класу IgG (рис. 4), а для хворих на ХК — наявність підвищеного титру IgА та IgG до ASCA.
При встановленому діагнозі ВК чутливість і специфічність тесту p-ANCA класу IgG становили 63 і 86 % відповідно. Тест ASCA (підвищений титр IgA або IgG) для діагностики ХК мав чутливість 72 % і специфічність 82 %. Комбінація «наявність p-ANCA класу IgG та відсутність IgA, IgG до ASCA» у пацієнтів з ВК показала чутливість і специфічність 75,6 і 68,8 % відповідно, з діагностичною точністю 68,8 % (табл. 2). У пацієнтів з ХК комбінація «підвищений титр IgA, IgG до ASCA та відсутність p-ANCA класу IgG» мала чутливість 81,3 % та специфічність 80 %, діагностичну точність 80,8 %. За нашими даними, одночасне визначення IgA, IgG до ASCA та p-ANCA класу IgG збільшує позитивну прогностичну точність при диференційній діагностиці ВК та ХК у пацієнтів із ЗЗК.
Обговорення
За літературними даними встановлено, що кількісне визначення автоантитіл може бути корисним для клінічної діагностики ЗЗК [5]. Р-ANCA являють собою групу автоантитіл з цитоплазматичними компонентами нейтрофілів як антигенами-мішенями, що можуть вивільняти лізоцими через капіляри, ушкоджувати кровоносні судини та тканини кишечника, а також спричиняти пошкодження тканин через Т-клітинно-опосередкований імунний синергізм [5].
У дослідженнях останніх років показано, що р-ANCA специфічно опосередковують такі захворювання, як гломерулонефрит, системний васкуліт, вузликовий гранулематоз і автоімунний гепатит, а також пов’язані з ВК. Іншими антитілами, тісно пов’язаними із ЗЗК, є IgА та IgG до ASCA. Механізми цих антитіл у розвитку ЗЗК можуть бути пов’язані з підвищеною проникністю кишечника при захворюванні та впливом на клітини імунної відповіді дріжджових антитіл [5, 6]. Визначаючи сироваткові рівні IgA та IgG до ASCA та р-ANCA класу IgG, ми досліджували клінічну значущість цих антитіл у диференційній діагностиці ЗЗК та можливих кореляційних взаємозв’язків з тяжкістю захворювання.
Антитіла IgA та IgG до ASCA визначаються у більшості випадків у пацієнтів зі встановленим діагнозом ХК і в найближчих родичів пацієнтів з ХК [10]. Роль Saccharomyces cerevisiae у патогенезі ХК до кінця не з’ясована. Цей вид дріжджів вважається умовно-патогенним маловірулентним збудником і значно поширений у побуті (хлібопекарське виробництво) та в харчовій промисловості. Приблизно 6 % нормального населення мають Saccharomyces cerevisiae у шлунково-кишковому тракті, які надходять з їжею, і їх наявність має тимчасовий характер [10, 11]. Saccharomyces cerevisiae рідко виявляються у пацієнтів із ХК з ASCA-IgA та ASCA-IgG, що вказує на те, що вони існують без постійного контакту з Saccharomyces cerevisiae.
Раніше припускали, що підвищена проникність кишечника бере участь у продукції ASCA у пацієнтів із ХК, але пізніше цю гіпотезу було піддано сумніву, оскільки не було виявлено зв’язку між рівнями IgA, IgG до ASCA і ступенем проникності кишечника у пацієнтів із ХК [6, 8].
У роботах авторів Y. Pang, S. Kansal було показано, що як рівень р-ANCA класу IgG, так і частота його позитивних результатів у пацієнтів з ВК були значно вищими, ніж в осіб без ВК та здорових осіб (p < 0,01). Однак рівні ASCA класу IgA та IgG та частота позитивних результатів у пацієнтів з ВК не мали статистичних відмінностей порівняно з показниками здорових осіб (p > 0,05). Чутливість р-ANCA+ та р-ANCA+/ASCA– у виявленні пацієнтів з ВК становила 61,90 та 55,24 % відповідно, тоді як специфічність — 91,45 та 94,08 % відповідно. Чутливість ASCA+ та ASCA+/ANCA– у пацієнтів з ВК становила 5,33 та 3,85 % відповідно, а специфічність — 83,9 та 88,78 % відповідно. Дослідниками було запропоновано використовувати визначення рівня р-ANCA в сироватці крові для діагностики ВК, а кількісне визначення рівнів р-ANCA IgG — для визначення тяжкості перебігу ВК [5, 12]. Результати наших досліджень були порівняні з літературними даними й показали, що при підтвердженні діагнозу ВК чутливість і специфічність тесту p-ANCA становили 63 і 86 % відповідно. Тест ASCA (позитивний IgA або IgG) для діагностики ХК мав чутливість 72 % і специфічність 82 %. Комбінація «p-ANCA класу IgG-позитивних і IgA, IgG до ASCA-негативних результатів» у пацієнтів з ВК показала чутливість і специфічність 75,6 і 68,8 % відповідно, з діагностичною точністю 68,8 %. Для комбінації «IgA, IgG до ASCA-позитивних і p-ANCA-негативних результатів» у пацієнтів з ХК чутливість становила 81,3 %, а специфічність — 80 %, з діагностичною точністю 80,8 %. Тому одночасне визначення IgA, IgG до ASCA та p-ANCA-IgG збільшує позитивну прогностичну точність при диференційній діагностиці ВК та ХК у пацієнтів із ЗЗК.
Висновки
1. У пацієнтів з ВК частіше виявляли р-ANCA класу IgG, а у хворих на ХК — підвищений титр IgА, IgG до ASCA, який залежав від ступеня тяжкості перебігу хвороби, що підтверджувалося встановленими кореляційними зв’язками з рівнями IgА до ASCA (r = 0,608; р = 0,012) та IgG до ASCA (r = +0,611; р = 0,012).
2. Встановлено, що окреме визначення показників IgА, IgG до ASCA та р-ANCA класу IgG для диференціації ВК та ХК має відносне значення, натомість при об’єднанні двох тестів прогностична цінність позитивного результату та специфічність можуть бути істотно збільшені. Проведення дослідження рівня цих маркерів у пацієнтів із ЗЗК сприяє диференційній діагностиці ВК та ХК.
Конфлікт інтересів. Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів та власної фінансової зацікавленості при підготовці даної статті.
Інформація про фінансування. Робота виконується відповідно до плану наукових досліджень ДУ «Інститут гастроентерології НАМН України» в рамках науково-дослідної роботи «Вивчити значення факторів гуморального імунітету та розробити комплекс критеріїв для прогнозування перебігу хронічних запальних захворювань кишечника» (номер держреєстрації 0119U102695). Усі пацієнти підписали інформовану згоду на участь у цьому дослідженні.
Внесок авторів. Степанов Ю.М. — концепція дослідження; Стойкевич М.В. — дизайн дослідження, оформлення статті; Гайдар Ю.А. — проведення морфологічних досліджень; Кленіна І.А. — аналіз біохімічних досліджень, аналіз літературних джерел, редагування статті; Татарчук О.М. — проведення імунологічних досліджень, редагування статті, оформлення статті.
Отримано/Received 04.08.2023
Рецензовано/Revised 16.08.2023
Прийнято до друку/Accepted 25.08.2023
/58.jpg)
/58_2.jpg)
/58_3.jpg)
/59.jpg)