Газета «Новости медицины и фармации» Инфекционные болезни, гепатология (281) 2009 (тематический номер)

Проблема нарушения функционального состояния сосудистого эндотелия, активное изучение которой ведется уже более 10 лет и характеризуется значительным количеством публикаций как в отечественной, так и в зарубежной печати, и по сей день не утратила своей актуальности, причем не только в силу обширного спектра заболеваний, с которыми ассоциирована эндотелиальная дисфункция (ЭД), не только вследствие поразительного многообразия процессов, находящихся под контролем сосудистого эндотелия, но также и вследствие того, что в сфере исследования патофизиологических механизмов, лежащих в основе нарушения функционального состояния сосудистого эндотелия, все еще остается значительное число неизученных вопросов. На сегодняшний день существуют бесспорные доказательства наличия у пациентов, страдающих гипертонической болезнью (ГБ), ЭД, под которой прежде всего подразумевают нарушение вазорегулирующей функции сосудистого эндотелия [1, 2]. Однако если фенотипические проявления изменения функциональных характеристик эндотелиальных клеток, регистрируемых у больных ГБ, известны довольно хорошо, то такой аспект формирования ЭД, как изменение степени экспрессии определенных генов, ответственных за функционирование эндотелиальных клеток в нормальных условиях, без которой, по всей видимости, невозможно формирование всего комплекса патофизиологических изменений, наблюдаемых при ЭД, исследован недостаточно.

Известно, что реализация генетической информации, потенциально заложенной в геноме эндотелиальных клеток, находится под сложным многоуровневым контролем, который и обеспечивает адаптацию эндотелиальных клеток к постоянно изменяющимся локальным условиям. При этом одним из основных регуляторов экспрессии генетической информации является система факторов транскрипции [3].

Одним из основных факторов транскрипции, представленных в эндотелиальных клетках, является Nuclear Factorkappa В (NF­κB), принадлежащий к Rel­семейству факторов транскрипции, предназначенных для передачи сигнала из цитоплазмы в ядро эндотелиальной клетки [3]. Гены, регулируемые NF­κB, являются критическими для развития всех видов защитных реакций организма, включая иммунные и воспалительные реакции. В качестве примера можно привести гены, регулирующие экспрессию цитокинов и интерлейкинов (интерлейкин­1, интерлейкин­2, интерлейкин­6, интерлейкин­8, ранулоцит­колониестимулирующий фактор), молекул клеточной ­адгезии (E­селектин, молекула межклеточной адгезии 1 (ICAM­1), молекула сосудистой адгезии 1), индуцибельной формы NO­синтазы, тканевого фактора и тканевого ингибитора плазминогена 1 [4, 5].

Проведенные недавно исследования показали, что NF­κB вовлекается в большое число патологических процессов, протекающих в сосудистой стенке, в частности, таких как рестеноз [4] и атеросклероз [6]. В противовес нормальному состоянию сосудистой стенки выраженная активация NF­κB обнаруживается в фиброзно измененной стенке сосудов и участках утолщения интимы­медии [6].

Указанные выше данные, а также отсутствие в научной литературе единого мнения о роли факторов транскрипции в формировании ЭД при ГБ обусловили выбор цели нашего исследования и послужили основанием для выбора в качестве объекта для изучения роли активации факторов транскрипции в изменении функционального состояния эндотелиальных клеток у больных ГБ именно NF­κB.

Цель исследования: изучить активность фактора транскрипции NF­κB и его роль в формировании эндотелиальной дисфункции у больных гипертонической болезнью.

Материалы и методы

Нами были обследованы 74 больных ГБ I–II стадии с I–III степенью артериальной гипертензии (АГ) по классификации WHO­ISH (1999), 48 мужчин, 36 женщин, средний возраст 46,39 ± 3,47 года. В исследование не включались пациенты с АГ симптоматического характера, страдавшие сахарным диабетом, гиперлипидемией, ишемической болезнью сердца или атеросклеротическим поражением артерий другой локализации, застойной сердечной недостаточностью и другими заболеваниями, при которых доказано формирование ЭД либо изменение активности NF­κB. В качестве контроля была обследована группа из 26 практически здоровых лиц, сопоставимая по полу и возрасту с основной группой. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией. Все обследованные выразили информированное согласие на участие в исследовании.

Всем пациентам была проведена венозная окклюзионная плетизмография верхних конечностей на аппарате ЭМПА 2­01 по методике Gutmann [7] для исследования кровотока по артериям предплечья с определением объемной скорости кровотока в покое (ОСКп) и после пробы с реактивной гиперемией (ОСКрг). Величину объемной скорости выражали в миллиметрах на 100 см3 в 1 минуту. Для оценки функционального состояния сосудистого эндотелия рассчитывали коэффициент механочувствительности сосудистого эндотелия (КМЧ), который выражали как процент разницы между должной и фактической ОСКрг (Патент Україна 35061 А МПК 6 А61В5/00. Спосіб діагностики порушень чутливості ендотелію артеріальних судин до напруження зсуву / Черепок О.О., Полівода С.М. (Україна). — № 99084494. Заяв. 05.08.99. Опублік.15.03.01. Бюл. № 2). КМЧ с достаточно высокой степенью точности характеризует одно из основных свойств эндотелия — его чувствительность к механическим стимулам, в том числе и к стимулам, формируемым движением крови по артериальным сосудам. Чем меньше величина КМЧ, тем менее чувствителен эндотелий сосудов к механическим стимулам; поскольку функциональное состояние эндотелия непосредственно зависит от его чувствительности к механическим стимулам, КМЧ может быть адекватным показателем, характеризующим функциональное состояние эндотелия.

Тот факт, что распределение величины КМЧ сосудистого эндотелия подчиняется нормальному закону, позволил нам разделить всех пациентов, страдающих ГБ, в соответствии с величиной КМЧ сосудистого эндотелия на 3 группы в зависимости от степени выраженности ЭД: 1­я группа — больные ГБ с умеренной ЭД (больные, у которых величина КМЧ сосудистого эндотелия была более, чем М + 1σ, где М — среднее арифметическое КМЧ сосудистого эндотелия в группе больных, а σ — величина среднего квадратического отклонения, однако меньше, чем величина КМЧ со­судистого эндотелия, равная М – 2σ в группе контроля, которую считали нижней границей нормы), 2­я группа — больные ГБ со средней ЭД (больные ГБ, у которых значение КМЧ находилось в пределах М ± 1σ), 3­я группа — больные ГБ с тяжелой ЭД (больные, у которых величина КМЧ сосудистого эндотелия была меньше, чем М – 1σ).

Так как непосредственное изучение NF­κB невозможно в силу особенностей его функционирования и облигатной внутриклеточной локализации, для определения степени его активности использовали стандартный метод, который применяется при изучении экспрессии генов: определяли концентрацию или степень экспрессии белковых продуктов, кодируемых определенным геном [5]. Так как уровень продукции эндотелиальной клеткой Е­селектина и ICAM­1 находится под контролем исключительно NF­κB, а другие клеточные популяции не способны синтезировать указанные вещества, определение содержания этих продуктов в крови, куда они поступают из эндотелиальных клеток, и будет служить мерой оценки степени активности NF­κB в эндотелиальных клетках [5, 8].

Исследование содержания в крови ICAM­1 проводилось иммуноферментным методом с использованием наборов фирмы HyCult (Голландия) по прилагаемой инструкции. Определение продукции Е­селектина проводилось оригинальным методом [9].

Исследуемые величины представлены в таком виде: выборочное среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения. При проверке статистических гипотез нулевую гипотезу отбрасывали при уровне значимости менее 0,05. Достоверность различий между выборочными средними величинами оценивали с помощью процедуры однофакторного дисперсионного анализа. Оценка степени взаимосвязи межу парами независимых признаков, выраженных в количественной шкале, осуществлялась с помощью процедуры ранговой корреляции K. Spearman. Статистически незначимые коэффициенты корреляции не рассматривались при дальнейшем анализе и в настоящей работе не приводятся. Наличие функциональной взаимосвязи между изучаемыми признаками оценивали, используя процедуру регрессионного анализа. Все статистические процедуры проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows 5.1 (StatSoft Inc.).

Результаты

Результаты проведенного исследования представлены в табл. 1. В целом по группе больных ГБ была отмечена достоверно более низкая величина КМЧ по сравнению с лицами контрольной группы, свидетельствующая о нарушении функционального состояния сосудистого эндотелия. Кроме того, больные ГБ характеризовались существенно большим содержанием ICAM­1 в сыворотке крови, превышавшим аналогичный показатель в группе контроля на 26,99 %, а также достоверно более высоким уровнем продукции Е­селектина (на 50,77 % выше, чем у лиц группы контроля).

Сравнение пациентов с различной степенью выраженности ЭД продемонстрировало, что больные 1, 2 и 3­й групп достоверно различались по уровню как систолического (АДс), так и диастолического артериального давления (АДд) таким образом, что у лиц с умеренной ЭД уровень АДс и АДд был минимальным, а у пациентов с тяжелой ЭД — максимальным. При этом по мере увеличения степени тяжести ЭД отмечались значительные изменения уровня продукции Е­селектина и содержания ICAM­1 в сыворотке крови. В частности, продукция Е­селектина у пациентов 2­й группы была достоверно выше на 32,70 %, чем у лиц 1­й группы, а у пациентов 3­й группы — на 55,84 и 17,44 % выше по сравнению с больными 1­й и 2­й групп соответственно. Сходная картина была отмечена и применительно к содержанию ICAM­1 в сыворотке крови: у пациентов 3­й группы данный показатель на 25,31 и 11,86 % превышал содержание ICAM­1 в сыворотке крови пациентов 1­й группы, а у больных 2­й группы был на 12,02 % достоверно выше, чем у лиц 1­й группы. Интересен тот факт, что даже в 1­й группе пациентов, где регистрировалась наименьшая степень выраженности ЭД, как продукция Е­селектина, так и содержание ICAM­1 в сыворотке крови достоверно превышали аналогичные параметры у лиц контрольной группы на 15,70 и 12,92 % соответственно.

Результаты проведенного корреляционного анализа (табл. 2) позволили выявить наличие сильной положительной взаимосвязи между уровнем продукции Е­селектина и величиной АДс, АДд и сильной отрицательной взаимосвязи с величиной КМЧ, в то время как между уровнем продукции Е­селектина и возрастом пациентов была выявлена корреляционная взаимосвязь средней силы. Сходная структура корреляционных взаимосвязей была зарегистрирована для содержания ICAM­1 в сыворотке крови и отличалась лишь абсолютной величиной коэффициентов корреляции.

Полученные в ходе корреляционного анализа данные послужили основой для проведения регрессионного анализа, где в качестве независимой переменной использовали содержание ICAM­1 в сыворотке крови, а в качестве зависимой переменной — величину КМЧ сосудистого эндотелия. Его результаты продемонстрировали, что между величиной КМЧ и уровнем ICAM­1 в сыворотке крови имеется статистически значимая взаимосвязь (β = –0,276, p < 0,001), адекватно аппроксимирующаяся моделью простой линейной регрессии. Более того, при пошаговом включении в регрессионную модель таких факторов, как уровень АДс и АДд, влияние которых на величину КМЧ также было достоверным, уровень ICAM­1 в сыворотке крови сохранял свою статистическую значимость как независимый фактор, определяющий величину КМЧ.

Обсуждение

Полученные нами в ходе исследования данные позволяют сделать целый ряд заключений, касающихся как изменения функционального состояния эндотелиальных клеток при ГБ, характеризуемого нарушением чувствительности сосудистого эндотелия к воздействию механического стимула, так и сопровождающих его изменений уровня экспресии в эндотелиальных клетках целого ряда субстанций, характеризующих степень активации генетического материала эндотелиальных клеток. В частности, большой интерес представляют данные о значительном увеличении у больных ГБ продукции Е­селектина и содержания ICAM­1 в сыворотке крови по сравнению с лицами группы контроля, поскольку, как мы уже упоминали выше, именно эти показатели являются специфическими маркерами активности NF­κB в эндотелиальных клетках, а достоверное увеличение их у пациентов с ГБ свидетельствует о существенном увеличении активности NF­κB в сосудистом эндотелии.

В целом ряде исследований было установлено, что увеличение активности NF­κB способствует активации основных генов, обусловливающих синтез и/или экспрессию эндотелиальными клетками биологически активных веществ, ответственных за переход ее в воспалительный (активированный) фенотип: фактора некроза опухоли альфа (TNF­α), интерлейкина­1 (IL­1), макрофаг­колониестимулирующего фактора (M­CSF), моноцит­хемоаттрактант протеина (MCP­1), трансформирующего фактора (TF), молекулы сосудистой клеточной адгезии (VCAM­1), молекулы межклеточной адгезии (ICAM­1), Е­селектина и ряда других [4, 5]. В свете этих данных выявленное нами увеличение активности NF­κB в клетках сосудистого эндотелия позволяет предположить, что логическим завершением увеличения активности фактора транскрипции NF­κB при ГБ является активация генетического материала эндотелиальных клеток, приводящая к существенному изменению параметров функционирования эндотелия, что может служить одной из главных причин формирования ЭД при ГБ.

В пользу последнего предположения свидетельствуют несколько фактов, полученных в ходе нашего исследования. Так, выявленное нами статистически значимое увеличение продукции Е­селектина и содержания ICAM­1 в сыворотке крови уже у пациентов с умеренной ЭД по сравнению с практически здоровыми лицами свидетельствует, что даже при наличии незначительно выраженной ЭД у пациентов с ГБ выявляются признаки активации NF­κB в клетках сосудистого эндотелия. Кроме того, нами было установлено, что прогрессирование ЭД сопровождается увеличением активности NF­κB в клетках сосудистого эндотелия, о чем свидетельствовало достоверное увеличение продукции Е­селектина и содержания ICAM­1 в сыворотке крови по мере прогрессирования ЭД. Наконец, наличие взаимосвязи между степенью активации NF­κB в клетках сосудистого эндотелия и выраженностью ЭД подтверждается результатами проведенных нами корреляционного и регрессионного анализов и, в частности, тем фактом, что между показателями активации NF­κB в эндотелиальных клетках и величиной КМЧ сосудистого эндотелия регистрировалась сильная отрицательная корреляционная взаимосвязь, а при формировании регрессионной модели, описывающей взаимосвязь КМЧ сосудистого эндотелия и различных факторов, оказывающих влияние на степень ЭД, активность NF-κB, оцененная по содержанию ICAM­1 в сыворотке крови, была независимым фактором, определявшим величину КМЧ.

Несмотря на то что на сегодняшний день мы не можем однозначно идентифицировать те механизмы, посредством которых NF­κB вовлекается в развитие ЭД у больных ГБ, результаты данной работы однозначно свидетельствуют, что формирование ЭД связано с фенотипическими проявлениями изменения активности генетического материала эндотелиальных клеток, опосредуемых с помощью одного из основных факторов транскрипции — NF­κB.

Выводы

1. У больных гипертонической болезнью происходит активация фактора транскрипции NF­κB в клетках сосудистого эндотелия, одним из проявлений которой является увеличение продукции Е­селектина и повышение содержания в сыворотке крови ICAM­1.

2. Активация NF­κB в клетках сосудистого эндотелия является независимым и патофизиологически значимым фактором, способствующим формированию эндотелиальной дисфункции у больных гипертонической болезнью.