Газета «Новости медицины и фармации» Офтальмология (363) 2011 (тематический номер)

С целью разработки новых и усовершенствования существующих способов лечения возрастных, диабетических и воспалительных заболеваний глаза в лаборатории биохимии на протяжении нескольких десятилетий проводятся серии экспериментальных и клинико-биохимических исследований по следующим направлениям:

1. Возрастная катаракта.

2. Возрастная макулодегенерация.

3. Диабетическая ретинопатия.

4. Герпетический кератит.

5. Глаукома.

6. Увеиты.

7. Стромальные дистрофии роговицы и рецидивирующие эрозии.

8. Создание искусственного и обработка натурального коллагенового матрикса роговицы.

На протяжении многих лет в лаборатории биохимии уделяется пристальное внимание проблеме возрастной катаракты (ВК), ведутся серьезные исследования в области изучения и профилактики этого заболевания.

Длительное время среди офтальмологов доминировало представление, что катаракта — неизбежный результат процесса старения тканей глаза, что в значительной степени тормозит развитие исследований по изучению патогенеза возрастной катаракты и разработке способов ее профилактики и лечения.

Основной вид помощи больным катарактой заключается в оперативном удалении помутневшего хрусталика. Но, несмотря на значительные успехи, достигнутые в микрохирургии катаракты, в последние три десятилетия проблема борьбы с инвалидностью по зрению вследствие катаракты не может быть решена только хирургическим путем. Результаты клинических наблюдений и экспериментальных исследований дают основание полагать, что изменения, возникающие при старении, способствуют образованию помутнений в хрусталике, но развитие катаракты далеко не всегда является неизбежным. В последние годы в мире развернут широкий фронт исследований по выяснению патогенеза возрастной катаракты, выполняются специальные программы по изучению хрусталика и основ катарактогенеза.

Основные направления, по которым ведутся исследования патогенеза возрастной катаракты, можно определить следующим образом:

1. Длительное изучение конкретных механизмов катарактогенеза на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях.

2. Выяснение прямых и дополнительных (косвенных) катарактогенных факторов и исследование механизмов их действия.

3. Разработка способов предупреждения возрастной катаракты (алиментарных, физических, биологических и др.) и методов ее лечения путем воздействия на основное звено или комплекс звеньев, ответственных за развитие катаракты.

Несмотря на достигнутые успехи в изучении механизмов развития помутнений при формировании катаракты, остаются невыясненными целый ряд вопросов относительно ее патогенеза. Так, основные физико-химические и биохимические параметры катарактогенеза исследованы главным образом на конечных стадиях развития катаракты, неясна степень обратимости предотвращения развития предкатарактальных повреждений белковых комплексов хрусталика путем стимулирования ключевых участков метаболизма. Нет ясности, как развивается катаракта у пожилых людей при различных состояниях системы дезинтоксикации организма. Необходимо также уточнить роль мембранного компонента в развитии различных форм катаракты, изучить действие стабилизаторов структуры и стимуляторов функции мембран на различных этапах развития возрастной катаракты.

Анализ основных достижений в области изучения патогенеза возрастной катаракты свидетельствует, что наряду с дальнейшим изучением молекулярных механизмов катарактогенеза крайне необходимы углубленные исследования пусковых механизмов и конкретных факторов внешней и внутренней среды организма, способствующих в различной мере возникновению и прогрессированию данного заболевания. В этом отношении очень ценной представляется концепция о прямом и непрямом катарактогенном действии различных факторов (синкатарактогенном и кокатарактогенном).

В связи с этим особую актуальность приобретает изучение глутатиона, главной функциональной особенностью которого является поддержание в восстановленном состоянии сульф­гидрильных групп белков, устранение свободных радикалов; интенсивно проводятся исследования по углубленному изучению физиологической роли глутатиона в хрусталике и других тканях глаза. Установлено, что в хрусталике отмечается самая высокая концентрация восстановленной формы глутатиона, при этом с возрастом уровень его заметно снижается. Резкое снижение содержания глутатиона наблюдается в катарактальных хрусталиках человека. Вообще, следует указать, что глутатион является центральным звеном в энзимокоферментной системе «гашения» свободных радикалов и обезвреживания токсических веществ.

С возрастом отмечается своеобразное старение метаболизма, снижается каталитическая активность ферментов, ослабляются процессы транспорта питательных веществ и нарушаются структурно-функциональные параметры мембран.

Результаты проведенных нами экспериментальных исследований убедительно доказали, что стабильность оптических свойств хрусталика при воздействии катарактогенного фактора света высокой интенсивности зависит от параметров глутатионового статуса организма.

В условиях, когда с помощью вводимого в организм ксенобиотика ацето­- аминофена мы снижали общий уровень глутатиона за счет активации глутатион-S-трансферазной реакции, частота возникновения и скорость развития патологических изменений в хрусталиках экспериментальных животных значительно повышалась.

Вышеуказанные результаты дают основание полагать, что при возникновении дефицита пула глутатиона в организме человека также снижается устойчивость хрусталика к действию различных физических и химических катарактогенных факторов. Следовательно, пониженный уровень глутатиона в крови человека можно рассматривать как фактор риска возникновения при ускорении развития катаракты.

Выявленный нами факт синкатарактогенного действия сниженного уровня глутатиона в организме человека может быть реализован при диарее и систематическом приеме ряда лекарственных препаратов, обезвреживание которых происходит с участием глутатиона (трансферазная реакция) и образованием конъюгатов между коферментом и ксенобиотиком. При диарее вследствие нарушения процессов всасывания снижается поступление в организм аминокислот-предшественников для синтеза глутатиона.

Следует подчеркнуть, что исследования возможности участия глутатиона в «гашении» свободных радикалов в хрусталике, а также предварительные результаты изучения превентивного действия глутатиона на развитие катаракты in vitro убеждают в той исключительной роли, которую играет глутатион в поддержании нативной конформации белковых структур хрусталика.

Все защитные функции глутатион выполняет в своей восстановленной форме; окисленный глутатион функционировать в реакциях защиты тканей глаза не может, и если он не восстанавливается глутатионредуктазой, то свободно диффундирует в камерную влагу, что ведет к снижению общего уровня глутатиона в хрусталике.

Установлено, что концентрация восстановленной формы глутатиона в хрусталике, наиболее высокая по сравнению с другими тканями организма, с возрастом значительно снижается. Доказано, что при экспериментальном катарактогенезе содержание восстановленной формы глутатиона уменьшается задолго до появления признаков помутнения хрусталика, резко снижен уровень восстановленного глутатиона в катарактальных хрусталиках человека. Скорость разложения хрусталиком перекиси водорода в первую очередь зависит от пула восстановленного глутатиона. Активность основных защитных антиокислительных систем определяется способностью поддерживать высокую концентрацию восстановленного глутатиона в клеточных элементах хрусталика. Установлено, что даже небольшое увеличение концентрации окисленного глутатиона ведет к ингибированию синтеза белка в хрусталике.

Уровень восстановленного глутатиона уменьшается при образовании всех типов катаракты, с которыми связываются нарушения ионного транспорта, увеличение гидратации и изменения в белках хрусталика.

Установлено, что в мутнеющих хрусталиках усиливаются процессы неферментативного гликозилирования кристаллинов, в результате снижается содержание сульфгидрильных групп кристаллиновой фракции, нарушается третичная структура водорастворимых белков, практически исчезает фракция g-кристаллинов, появляются растворимые и нерастворимые в воде высокомолекулярные белковые агрегаты.

Накопленные к настоящему времени материалы экспериментального и клинического характера позволяют предполагать, что значительная роль в обеспечении стабильности структур хрусталика принадлежит адекватному аминокислотному обеспечению происходящих в нем метаболических и биофизических процессов. Одна из важнейших функций аминокислот (глицин, глутамин, цистеин) в хрусталике состоит в их использовании для биосинтеза глутатиона, который, как известно, является главным компонентом, обеспечивающим нативность хрусталиковых волокон, защищая белковые и липопротеидные компоненты мембран от свободно-радикального повреждения, и участвующим в их регенерации.

Имеется довольно немного работ, посвященных изучению уровня и обмена аминокислот в процессах катарактогенеза. В основном в этих работах приводятся данные об уровне протеиногенных аминокислот в катарактальном хрусталике. И совершенно недостаточно изучен обмен глутатионогенных аминокислот. Выяснена, в частности, лимитирующая роль первой стадии биосинтеза глутатиона и уровня цистеина в обеспечении хрусталика глутатионом. Следует отметить, что имеются сообщения о возможности транспорта глутатиона в хрусталик. Однако, как известно, с возрастом уровень этого кофермента в крови понижается, и поэтому приобретает особую актуальность изучение состояния энзиматических процессов синтеза глутатиона в хрусталике и обеспеченности его соответствующими аминокислотами.

С целью выяснения механизмов нарушений поступления в хрусталик достаточного количества глутатиона нами были проведены исследования действия световой энергии в различных условиях эксперимента на ферменты, осуществляющие биосинтез глутатиона — гамма-глутамилцистеинсинтетазу и глутатионсинтетазу.

Моделирование световой катаракты приводило к снижению активности гамма-глутамилцистеинсинтетазы и глутатионсинтетазы на 56 и 68 % соответственно. Этот факт можно рассматривать как важное звено механизма катарактогенного действия световой энергии на хрусталик, так как снижение уровня глутатиона, наблюдаемое в хрусталиках при развитии возрастной экспериментальной катаракты, резко уменьшает его устойчивость к действию катарактогенных факторов.

В опытах по изучению действия глутатионогенных аминокислот нами был обнаружен выраженный защитный эффект препаратов цистеина при развитии световой экспериментальной катаракты.

Сравнивая действие глицина и глутамата на скорость развития помутнений хрусталика при моделировании световой катаракты на протяжении 45 недель, нам не удалось выявить достоверных различий между группами, получавшими только световое воздействие, и группами, получавшими дополнительно глицин или глутамат. В экспериментах с применением препарата цистеина (ацетилцистеина) после 30-недельного облучения 30 % хрусталиков оставались прозрачными, тогда как в экспериментах со световым воздействием — только 9 % хрусталиков оставались прозрачными (р = 0,014).

В последний срок наблюдения, 45 недель, защитный эффект цистеина при моделировании световой катаракты был более выраженным: в группе со световым воздействием не было ни одного прозрачного хрусталика, тогда как в группе с применением препарата цистеина 20 % хрусталиков оставались прозрачными (р = 0,027).

Сопоставляя полученные нами результаты с данными исследований, при которых использовали препарат факовит, включающий комплекс аминокислот и витаминов, необходимо отметить, что результаты, полученные нами при использовании только одного препарата цистеина при моделировании экспериментальной катаракты в значительной степени адекватны. Таким образом, основным компонентом, обладающим защитным эффектом в препарате факовит, можно полагать, является входящий в его состав цистеин.

В общем, анализ результатов экспериментальных и клинико-биохимических исследований дает основание полагать, что в состав комплексной терапии возрастной катаракты целесообразно включать глутатионогенные аминокислоты, и в первую очередь препараты цистеина.

Анализ основных элементов патогенеза возрастной катаракты позволяет заключить, что наиболее перспективным путем усиления антикатарактогенного статуса хрусталика может стать дополнительное поступление в организм глутатионогенных аминокислот в комплексе с таким антиоксидантом, как аскорбиновая кислота, а также витамином В6, способствующим транспорту вышеуказанных аминокислот в клеточные структуры различных тканей организма. Указанное обстоятельство является очень важным при составлении медикаментозной композиции, используемой для профилактики и терапии возрастной катаракты.

Аскорбиновая кислота и пиридоксин также входят в состав препарата факовит наряду с цистеином, глютаминовой кислотой и глицином. Этот препарат, предложенный украинскими разработчиками, является аналогом французского препарата факолена, который особенно показан пациентам, склонным к аллергическим поражениям глаз (при блефарите, конъюнктивите, точечном кератите и прочих), которые могут развиваться после инстилляций катахрома, витаидурола, рибофлавина, цитраля, тиамина и тауфона.

Возможность повышения устойчивости хрусталика к действию катарактогена (свет высокой интенсивности) доказана в наших экспериментах с применением препарата факовит. В этих условиях было отмечено отчетливое уменьшение частоты появления и замедление скорости развития нарушений прозрачности хрусталика.

Эти факты можно объяснить на основании результатов экспериментов, в которых было показано, что с помощью энтерального введения аминокислот удается повысить их уровень в хрусталике и, таким образом, стимулировать образование лентикулярного глутатиона.

По нашему мнению, способ модулировать уровень глутатиона в хрусталике с помощью энтерального введения аминокислот является наиболее перспективным, так как дает возможность обеспечить более стабильный уровень глутатиона в тканях глаза за счет регуляции уровня аминокислот в крови. Это заключение подкрепляется и данными о регуляции уровня глутатиона в тканях за счет пула аминокислот в крови.

Проведение клинико-биохимических исследований крови у больных с различными клиническими формами возрастной катаракты выявило ряд особенностей: уровень глутатиона снижен, как правило, в крови всех больных возрастной катарактой. Однако наиболее существенная степень снижения уровня кофермента характерна для больных со смешанной формой возрастной катаракты.

Сравнительные исследования содержания глутатиона в катарактальных хрусталиках показали, что самый низкий уровень восстановленного глутатиона отмечается при смешанной форме катаракты.

Сопоставление концентрации восстановленной формы и общего содержания глутатиона в крови и хрусталиках больных с возрастной катарактой выявило значительную степень коррелятивной связи между биохимическими показателями. Этот факт является доказательством в пользу наличия взаимосвязи между глутатионовой системой организма (крови) и хрусталика.

Что касается механизмов выявленного нами нарушения глутатионового статуса организма у больных с возрастной катарактой, то важную роль здесь могут играть нарушения энзиматических систем, осуществляющих окислительно-восстановительные превращения глутатиона, которые были обнаружены в ряде клинико-биохимических исследований. Кроме того, определенное значение в указанном механизме могут иметь также данные о снижении общего уровня гидрофильных и липофильных антиоксидантов в крови больных возрастной катарактой.

Снижение восстановительного потенциала глутатионовой системы может приводить у больных к повышению скорости перекисного окисления липидов и, прежде всего, к накоплению в организме конечных продуктов этого процесса (МДА и др.), так как известно, что глутатион участвует в регенерации перекисных форм липидов с помощью фермента глутатионпероксидазы.

Таким образом, выявленные нами нарушения глутатионового статуса организма больных возрастной катарактой с учетом той роли, которую играет глутатион в защитно-приспособительных процессах, можно рассматривать, как важнейшее звено патогенеза возрастной катаракты. Это приобретает особую актуальность в связи с тем, что при многих патологических состояниях организма, а также при приеме ряда лекарственных препаратов и воздействиях негативных производственных факторов происходит снижение уровня глутатиона в организме и нарушается функциональное состояние его окислительно-восстановительной системы.

Особый интерес представляют результаты исследований, в которых больные со зрелой катарактой на одном глазу и незрелой на другом получали в течение месяца препарат факовит. Данные этих исследований носят весьма неоднозначный характер. Полученные результаты свидетельствуют о том, что коррекция глутатионового статуса с помощью препарата факовит в дозировке, указанной производителем, не привела к достоверному повышению уровня глутатиона в крови. Этот факт свидетельствует о различиях патогенеза отдельных клинических форм возрастной катаракты и отличиях метаболического статуса у пациентов с разными формами заболеваний.

В целом полученные нами результаты свидетельствуют о возможности коррекции глутатионового статуса организма больных катарактой и являются клинико-экспериментальным обоснованием для включения коррекции глутатионового статуса в систему медикаментозного лечения возрастной катаракты. Они также свидетельствуют о необходимости дифференцированного подхода к проведению метаболической коррекции глутатионовой системы в комплексном лечении этого заболевания.

Особо тщательно изучены система восстановительного метаболизма глутатиона, гексозофосфатный шунт, активность ферментов регенерации окисленной формы глутатиона и восстановления поврежденных белков с ее помощью (глутатионредуктаза), а также глутатионовых ферментов детоксикации (глутатионпероксидаза и глутатионтранс­фераза). Установлено значительное ингибирование глутатионзависимых ферментов, снижение содержания селена и глутатиона, активности каталазы и супероксиддисмутазы. Установлена также важная роль витаминов в антирадикальной защите хрусталика.

Кроме того, на примере препарата липофлавон изучено влияние био­- флавоноидов (в данном случае — кверцетина) на уровень активности антиоксидантных ферментов у больных возрастной катарактой. При применении данного препарата в наибольшей степени сокращались сроки регрессии признаков воспалительного процесса после хирургического лечения данного заболевания.

Естественно, что наиболее перспективным путем терапии катаракт является медикаментозное корригирование дефектов метаболизма, ведущих к помутнению хрусталика. Если этиопатогенетические факторы помутнения известны, то успешное лечение общего заболевания приостанавливает процесс помутнения хрусталика.

Наряду с проблемой возникновения, лечения и профилактики катаракты существует целый ряд не менее важных вопросов, касающихся других серьезных заболеваний органа зрения. Одним из таких заболеваний, приводящих к необратимой потере зрения, является макулодегенерация (МД).

Существующие методы профилактики и лечения этого заболевания нельзя признать удовлетворительными. Это обстоятельство диктует необходимость углубленного изучения патогенеза этого заболевания с целью поиска новых способов лечения, а также совершенствования уже существующих методов медикаментозной терапии данной патологии.

В патогенезе макулодистрофии весомым фактором, который инициирует возникновение свободных радикалов, является влияние солнечной энергии на сетчатку глаза и дисбаланс в равновесии между процессами перекисного окисления липидов и антиоксидантной системой защиты.

Глутатион, который является главным компонентом тиолдисульфидной системы, принадлежит к эндогенным антиоксидантам. Это наиболее распространенный внутриклеточный небелковый тиол, который устанавливает главный клеточный фонд мобильных сульфгидрильных групп, и синтез которого протекает во всех клетках. Основные функции этого трипептида — защита тиоловых групп белков от окислительного повреждения, гашение свободных радикалов, ликвидация чужеродных органических веществ, участие в транспортировке аминокислот через клеточные мембраны и др. Все защитные функции выполняет тиоловая форма глутатиона. Дисульфидная форма глутатиона функционировать в реакциях защиты тканей глаза не может. Поэтому, если она не обновляется глутатионредуктазой в тиоловую форму, то происходит снижение основного уровня обновленного потенциала тиол-дисульфидной системы глутатиона.

Результаты наших исследований показали, что содержание тиоловой формы глутатиона в сетчатке снижался на 26,3 %, а уровень дисульфидной формы повышался на 29,9 % по отношению к контролю. При этом отношение тиоловой формы глутатиона к дисульфидной уменьшалось в 1,76 раза.

Обнаруженные в этих условиях нарушения обмена и функции глутатиона, который играет важнейшую роль в обеспечении функционального и структурного статуса нейроэпителия сетчатки глаза, можно рассматривать как результат весомого влияния света высокой интенсивности на орган зрения.

При этом достоверно повышалась активность глутатионпероксидазы на 32,2 % и снижалась активность глутатионредуктазы — на 26,4 % и активность глутатион-S-трансферазы — на 23,1 %.

Таким образом, результаты исследований показали, что влияние света высокой интенсивности на сетчатку животных в значительной мере нарушает окислительно-восстановительную систему глутатиона и вызывает дестабилизацию мембран лизосом пигментного эпителия.

Для исследования влияния света высокой интенсивности на сетчатку экспериментальных животных в условиях пониженного уровня обновленного потенциала тиолдисульфидной системы глутатиона в организме мы применили ксенобиотик — ацетаминофен.

Полученные нами результаты эксперимента убедительно свидетельствовали, что в условиях, когда в организме осуществляется ускоренное использование глутатиона в процессах детоксикации, снижается стабильность мембран лизосом пигментного эпителия сетчатки.

Для оценки тиолового статуса больных «сухой» формой возрастной макулодистрофии была исследована кровь на содержание разных форм глутатиона. Следует обратить внимание, что для получения чистоты исследования отбирались больные только с двусторонней стадией заболевания.

Анализ полученных нами результатов показал, что наиболее существенным моментом в нарушении окислительно-восстановительной тиолдисульфидной системы в крови больных макулодистрофией является значительное повышение содержания дисульфидной формы глутатиона на 74,5 %, тогда как уровень тиоловой формы снижается на 15,3 % в сравнении с контрольной группой. Механизм этого может быть связан с повышением уровня свободнорадикальных веществ, при нейтрализации которых осуществляется более интенсивное образование дисульфидной формы трипептида. Значительный вклад в этот патологический процесс может вносить также активация глутатионпероксидазной системы, которая наблюдается у больных возрастной макулодистрофией. Изменения общего глутатиона в крови таких больных в сравнении с контрольной группой несущественны, то есть при данном заболевании характерным является перераспределение концентрации между тиоловой и дисульфидной формами глутатиона. Значительное снижение величины соотношения уровня тиоловой формы глутатиона и дисульфидной свидетельствует о том, что при «сухой» форме возрастной макулодистрофии уменьшается обновляющий потенциал тиол-дисульфидной системы глутатиона.

Обновленный потенциал тиолдисульфидной системы глутатиона в крови больных возрастной макулодистрофией существенно снижен, что приводит к очень неблагоприятным условиям для ликвидации оксидативного стресса, который является важным звеном патогенеза этого заболевания. В связи с этим важную роль в лечении может играть повышение обновленного потенциала тиолдисульфидной системы глутатиона у таких больных. Поэтому рекомендовано было бы включать в терапию препараты, которые стимулировали бы глутатионредуктазную реакцию и благоприятствовали бы возникновению обновленной формы никотинамидных коферментов, необходимых для реакций регенерации дисульфидной формы глутатиона. В результате таких исследований можно установить, насколько эффективной может быть коррекция нарушений тиолового обмена у больных «сухой» формой макулодистрофии.

Впервые было установлено, что с помощью парентерального введения биологического препарата коэнзим композитум удается нормализовать нарушения тиолового обмена за счет снижения концентрации дисульфидной формы глутатиона и повышения уровня тиоловой формы, а также улучшить показатели перифовеолярного кровообращения и функционального состояния макулярной области сетчатки больных «сухой» формой возрастной макулодистрофии.

Таким образом, полученные данные убедительно свидетельствуют о возможности коррекции нарушений тиолового обмена у больных «сухой» формой макулодистрофии с помощью комплексного биологического препарата коэнзим композитум и обосновывают целесообразность его включения в систему медикаментозного лечения этого заболевания.

В настоящее время диабетическая ретинопатия (ДР) занимает лидирующее место среди причин слепоты и инвалидности офтальмологических больных. Чрезвычайная сложность патогенетических механизмов возникновения и развития ДР, а также недостаточная эффективность существующих методов медикаментозной терапии этого заболевания требуют проведения углубленных исследований по выяснению пусковых механизмов, лежащих в основе необычайно большого количества сосудистых, биохимических и иммунологических нарушений.

В последние годы наши знания о патогенезе диабетических осложнений приобрели более четкий характер, и в качестве ведущих механизмов развития ДР рассматриваются повреждения белков, обладающих каталитическими и регуляторными функциями. В последнем случае получены доказательства о ключевой роли активации протеинкиназы-С в патогенезе диабетических осложнений.

В качестве пусковых метаболических нарушений, приводящих к поражению сосудистой, нервной и других тканей организма, рассматривается повышенный уровень не только глюкозы, но и целого ряда метаболитов углеводно-фосфорного и липидного обменов, таких как метилглиоксаль, ацетоацетат, диацилглицерин, дезоксиглюкоза и других. Повышение концентрации этих метаболитов отрицательно отражается на состоянии обмена веществ и вызывает нарушения регуляции обмена и функции клеток. Происходит резкая активация процессов свободнорадикального окисления, при этом антирадикальная система организма не в состоянии полностью обезвредить токсические радикалы, вследствие чего их избыточное количество повреждает мембранные структуры, белки, липиды, нуклеиновые кислоты и т.д.

Важнейшим звеном детоксикационной системы организма и тканей глаза, в частности, обезвреживающей вышеназванные токсические метаболиты и «гасящей» свободные радикалы, является окислительно-восстановительная система глутатиона.

Функциональный статус глутатионовой системы детоксикации зависит, в первую очередь, от соотношения окисленных и восстановленных форм никотинамидных коферментов и пентозофосфатного цикла, при котором ключевым ферментом является транскетолаза с ее коферментом — тиаминпирофосфатом.

В нашей лаборатории биохимии была проведена экспериментально-исследовательская работа по выяснению возможности корригирующего действия аминокислот, входящих в состав препарата факовит, на общее содержание глутатиона, а также его окисленной и восстановленной форм в сетчатке крыс со стрептозотоциновым диабетом.

Согласно полученным данным, при развитии экспериментального диабета через 10 дней концентрация восстановленной формы глутатиона значительно снижалась (более чем наполовину), тогда как уровень окисленной формы кофермента имел тенденцию к повышению.

Через 28 дней содержание восстановленного глутатиона было еще более снижено (40 % по отношению к конт­ролю), при этом показатели уровня окисленного глутатиона также достоверно снижались (на 15 % по отношению к контролю).

Анализ соотношения окисленной и восстановленной форм глутатиона свидетельствовал, что при развитии стрептозотоцинового диабета отмечалось резкое снижение восстановительного потенциала глутатионовой системы, в первую очередь за счет резкого снижения уровня восстановленной формы кофермента.

В механизме изменения соотношения окисленной и восстановленной форм глутатиона, предположительно, важную роль играет стимуляция глутатионпероксидазной реакции, обезвреживающей гидроперекиси липидов, уровень которых при диабете, как известно, значительно возрастает. Следует также учесть, что восстановленная форма глутатиона может непосредственно «гасить» свободнорадикальные соединения, кроме того, снижение общего уровня восстановленного глутатиона может происходить за счет образования конъюгатов глутатиона с оксоальдегидами и другими токсическими соединениями, которые в таком связанном виде выводятся из организма.

В механизме нарушения соотношения окисленной и восстановленной форм глутатиона существенную роль может играть повреждение окислительно-восстановительной системы никотинамидных коферментов, так как восстановленная форма НАДФ обеспечивает регенерацию окисленного глутатиона за счет глутатионредуктазной реакции.

Отмеченные нарушения глутатионовой системы в сетчатке глаз животных при моделировании диабета, несомненно, являются важнейшим звеном патогенеза диабетической ретинопатии. Это положение подтверждается также той ролью глутатиона, которую он играет в физиологии органа зрения и сетчатки в особенности. Как известно, глутатион обеспечивает процессы транспорта аминокислот, регенерацию тиоловых групп белков, процессы детоксикации и «гашения» свободных радикалов, а также участвует в регуляции обменных процессов через функционирование тиоредоксиновой системы.

Сопоставление изменений общего уровня глутатиона и соотношения его окисленной и восстановленной форм свидетельствует о том, что при развитии экспериментального диабета в начальный период происходят нарушения окислительно-восстановительной системы глутатиона. Наряду с этим повышается его необратимое расходование в процессах обезвреживания токсических веществ, в частности метилглиоксаля с помощью глиоксалазной реакции. В итоге возникает значительный дефицит общего содержания глутатиона, и в первую очередь его восстановленной формы.

Целесообразность коррекции глутатионовой системы в сетчатке при диабете обусловлена, с одной стороны, необходимостью активизации эндогенной антиоксидантной системы, а с другой — возможностью ингибировать протеинкиназу-С с помощью повышенного уровня глутатиона. Как известно, указанные метаболические нарушения являются главными звеньями механизма развития диабетической ретинопатии.

Поиск способов коррекции глутатионового статуса актуален также и потому, что в основном препараты, применяемые в арсенале медикаментозного лечения при диабетических осложнениях, включая ингибиторы протеинкиназ, практически не оказывают влияния на дефицит глутатиона в нервной ткани при диабете.

Использование факовита оказывало однонаправленное воздействие на уровень как окисленной, так и восстановленной формы кофермента; концентрация восстановленного глутатиона повышалась до 60 %, а уровень окисленного глутатиона — до 115 % по сравнению с контролем.

Необходимо отметить, что первичные нарушения глутатионового статуса в нервных тканях при диабете не связаны с развитием сосудистой патологии, и в частности с ишемическим фактором.

Полученные в результате исследования факты свидетельствовали о выраженном позитивном влиянии факовита на состояние антиоксидантного статуса сетчатой оболочки. В спектре благоприятного влияния изучаемого препарата на сетчатку следует учесть, что глутатион оказывает ингибирующее влияние на активированную при диабете систему протеинкиназы-С. Этот элемент является особо важным, так как ингибирование протеинкиназы-С не обладает побочными отрицательными свойствами, характерными для предлагаемых с лечебной целью в настоящее время синтетических ингибиторов этого фермента.

В последнее десятилетие на первое место среди воспалительных заболеваний роговой оболочки вышли вирусные заболевания, среди которых доминирует вирусное заболевание герпетической этиологии. Так, наиболее частым проявлением вирусного повреждения глаза является герпетический кератит (ГК).

На сегодняшний день герпетические кератиты широко распространены из-за склонности к рецидивам (в 50–80 % случаев), трудностей в лечении и нередко тяжелых последствий. Частота рецидивов герпетического кератита после первой атаки инфекции в ближайшие 2 года — от 25 до 33 %, после второй — от 43 до 50 %. Следует отметить, что каждый последующий рецидив протекает тяжелее, чаще приводит к образованию помутнений роговицы, и тогда необходимо проведение кератопластики.

Главными особенностями герпесвирусов являются: пожизненное персистирование в организме однажды инфицированного человека, зависимость течения хронического инфекционного процесса от состояния иммунитета вирусоносителя, склонность к рецидивированию. Пожизненная персистенция герпесвирусов в организме человека обусловлена их уникальной способностью инкорпорировать свой ДНК в нейроны региональных ганглиев чувствительных нервов периферической нервной системы. Этот способ сохранения паразитирующего генома в организме человека приводит к тому, что в межрецидивный период герпетической инфекции иммунная система, не имея доступа во внутриклеточную среду, не может предотвратить его размножение в клетках.

Следует указать, что терапия герпетического кератита в последние годы достигла значительного прогресса. Местным и системным применением виростатиков удается довольно успешно контролировать процесс репликации вируса герпеса. В то же время противовирусная терапия не гарантирует предотвращения рецидивов заболевания. В связи с этим разработка новых способов лечения герпетического кератита и профилактика его рецидивов является актуальной проблемой офтальмологии и требует углубленного изучения патогенетических механизмов этого заболевания.

Вирус герпеса (или герпетическая инфекция) может поражать все слои роговицы — эпителий, строму, эндотелий, вызывая различные клинические формы заболевания, каждая из которых имеет свои патогенетические особенности.

При эпителиальных формах герпетической инфекции происходит прямое вирулитическое повреждение клеток эпителия вследствие активной репликации вируса в роговичном эпителии, распространяющегося по нерв­ным окончаниям тройничного нерва.

В исследованиях ряда авторов за последние годы показано, что существенную роль в репликации вируса играет оксидантное окружение клеток, и изменение внутриклеточного окислительно-восстановительного состояния глутатиона является ключевым моментом в развитии вирусной инфекции вследствие увеличения скорости вирусной репликации вируса или активирования факторов ядерной транскрипции.

В то же время состояние глутатионовой окислительно-восстановительной системы организма, инфицированного вирусом герпеса, остается неизученным.

В последнее время появились сообщения о том, что применение восстановленного глутатиона подавляет репликацию вируса простого герпеса, а также вируса иммунодефицита. В эксперименте показано, что восстановленный глутатион ингибирует пост­- транскрипциональную стадию вирус­ной репликации.

Имеющиеся данные о важной роли глутатиона в ответной реакции организма на вирусную инфекцию явились основанием для целевой установки, заключающейся в поиске способа подъ­ема уровня внутриклеточного глутатиона в роговице.

Так, на базе НИИ им. акад. В.П. Филатова была проведена экспериментально-исследовательская работа по выяснению эффективности медикаментозного лечения поверхностного ГК путем коррекции нарушений тиолового статуса организма на основе изучения его роли в патогенезе заболевания.

В процессе выполнения этой работы использовался препарат, в состав которого включены серосодержащие аминокислоты, используемые для биосинтеза глутатиона, — факовит.

В проведенных экспериментальных исследованиях было показано, что уровень восстановленного глутатиона в роговице в процессе развития моделированного герпетического кератита значительно снижался. При этом на 5-е сутки его уровень снизился более чем на 2/3. Высокая степень снижения отмечалась и на 12-е сутки развития герпетического кератита. На 21-е сутки уровень восстановленного глутатиона был снижен наполовину по сравнению с контролем. И только в конце периода наблюдений (34-е сутки) его уровень статистически не отличался от контроля.

В этих же условиях содержание окисленного глутатиона в роговице значительно повышалось, достигая наиболее существенного подъема на 12-е сутки, когда его уровень превышал контрольные величины почти в 2 раза.

Результаты исследования уровня восстановленного глутатиона в камерной влаге также показали его значительное снижение в период 5-х и 12-х суток наблюдения.

Содержание окисленного глутатиона в камерной влаге экспериментальных животных повышалось на 5-е сутки более чем на треть.

Принимая во внимание ту значительную роль, которую играет глутатион в метаболизме роговой оболочки, выявленные нами нарушения его содержания и соотношения окисленной и восстановленной формы можно рассматривать как важное патогенетическое звено в развитии герпетических процессов в роговице.

Учитывая имеющиеся литературные данные о роли восстановленного глутатиона в развитии вирусных заболеваний, а также о влиянии экзогенно применяемого глутатиона на репликацию вируса герпеса, были проведены эксперименты по выяснению возможности коррекции уровня этого важнейшего тиола в роговице и камерной влаге с помощью серосодержащего аминокислоты препарата факовит.

Полученные результаты с применением указанного препарата в условиях моделирования герпетического кератита выявили значительное повышение уровня тиоловой формы глутатиона в роговице и камерной влаге экспериментальных животных. При этом уже в ранние сроки наблюдения под влиянием исследуемого препарата концентрация восстановленного глутатиона значительно повышалась. На 21-е сутки его уровень в роговице почти в 2 раза превышал его концентрацию у нелеченых животных.

В камерной влаге животных, получавших препараты серосодержащих аминокислот, также отмечалось значительное повышение уровня восстановленной формы глутатиона.

Полученные данные показали возможность эффективной коррекции уровня тиоловых соединений в тканях глаза животных при развитии герпетического кератита посредством применения препарата, в состав которого включены серосодержащие аминокислоты. Это влияние можно рассматривать как элемент патогенетически ориентированного лечебного воздействия на патологический процесс в роговице при развитии вирусного кератита.

Анализ биохимических исследований слезной жидкости и крови у больных герпетическим кератитом в процессе лечения выявил, что включение в состав комплексной терапии препарата факовит (основная группа) приводило к выраженной нормализации тиолового статуса в организме больных и оказывало положительное влияние на динамику биохимических показателей в слезной жидкости в процессе проведения медикаментозной терапии.

Исследуемый препарат способствовал снижению активности окислительно-восстановительных ферментов в слезной жидкости больных вирусным кератитом. Этот факт свидетельствовал о том, что факовит снижал оксидативный стресс, наблюдаемый при развитии герпетического кератита. Об этом также свидетельствует повышение активности глутатионпероксидазы в крови и слезной жидкости в условиях применения препарата серосодержащих аминокислот.

В целом результаты проведенных экспериментальных и клинических исследований раскрыли существенное звено патогенеза герпетического кератита и показали, что тиолдисульфидный обмен при этом заболевании нарушается не только локально в тканях глаза, но и затрагивает весь организм, пораженный данным вирусом. Выявленные нарушения тиолдисульфидного статуса поддаются коррекции с помощью препаратов серосодержащих аминокислот.

Также проводились у нас исследования по изучению активности окислительно-восстановительных ферментов в слезной жидкости больных герпетическим кератитом в контрольной и основной группах до и после лечения, а также в группе доноров.

В ходе исследования установлено, что активность оксидоредуктаз в слезной жидкости больных герпетическим кератитом резко повышалась до лечения как в контрольной группе, так и в основной. Наиболее значительное изменение характерно для лактатдегидрогеназы, активность которой в слезе больных кератитом повышалась в среднем в 16 раз. Активность малатдегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы повышалась в среднем в 2 и 4 раза соответственно. Представленные данные о состоянии активности изучаемых ферментов в слезной жидкости являются патогномоничными и отражают степень деструкции эпителиальных клеток роговицы под влиянием вируса простого герпеса.

Интересно отметить, что активность ключевого фермента антиоксидантной системы — глутатионпероксидазы — в слезной жидкости у больных герпетическим кератитом была снижена более чем в 2 раза. Это положение отражает то состояние оксидативного стресса, в котором находится ткань роговицы при герпетическом кератите. Следует отметить, что по сравнению с нормой изменение активности всех указанных ферментов было достоверно в высокой степени.

Полученные результаты подтвердили положение о том, что в патогенезе герпесвирусных поражений роговой оболочки значительную роль играют нарушения ферментативной регуляции местных окислительно-восстановительных процессов.

Анализируя данные, полученные при изучении уровня тиоловых со­единений и окислительно-восстановительных ферментов в крови больных герпетическим кератитом, следует отметить, что использование тиоловых соединений оказывает выраженное благоприятное влияние как на состояние окислительно-восстановительных процессов, так и на состояние антиоксидантной системы. Этот факт раскрывает важный патогенетически ориентированный механизм комплексной терапии герпетических кератитов, обусловленный включением тиоловых препаратов.

Как признано Всемирной организацией здравоохранения, уровень глутатиона в крови рассматривается как индекс здоровья и старения организма, то есть чем выше уровень этого кофермента в организме, тем выше жизнеспособность, защитно-приспособительный потенциал и эффективнее замедляются процессы старения организма.

Актуальность проблемы лечения первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ) обусловлена высокой заболеваемостью, приводящей к необратимой потере зрения, и отсутствием радикальных способов ее медикаментозного лечения. Нестойкость лечебного эффекта антиглаукоматозных вмешательств, как правило, связывают с быстрым рубцеванием путей оттока внутриглазной жидкости (образованных во время проведения антиглаукоматозных вмешательств) с возникновением кистозных фильтрационных подушек, с развитием в послеоперационном периоде иридоциклитов, гипотонии, цилиохорио­идальных отслоек.

Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что активные формы кислорода играют существенную роль в патогенезе послеоперационной воспалительной реакции, а дополнительная их генерация в условиях эксперимента повышает степень воспалительного процесса после оперативного вмешательства на глазу. Показано, что свободнорадикальные формы кислорода усиливают образование фиброзной ткани, способствуют персистенции пролиферации фибро­бластов и пролонгации фибротического процесса.

В связи с этим актуальны исследования по выяснению роли свободнорадикальных веществ в развитии процесса рубцевания после хирургического лечения открытоугольной глаукомы и выявлению путей регуляции этого процесса.

Для достижения этой цели в лаборатории биохимии в экспериментальных условиях исследовалось действие активных форм кислорода на функциональные группы белковых структур склеры, изучалось влияние «гасителей» свободнорадикальных веществ (супероксиддисмутаза, каталаза и эмоксипин) на особенности процесса образования рубцовой ткани при регенерации склеры.

У животных как экспериментальной, так и контрольной группы после эксперимента определялся уровень функциональных сульфгидрильных, дисульфидных, карбоксильных и аминогрупп в белках тканей корнеосклеральной зоны, где проводилось оперативное вмешательство. В то же время для исследования активности антиоксидантных ферментов глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы и каталазы использовали камерную влагу, кровь и ткани склеры лимбальной зоны. Интенсивность появления основного белка соединительной ткани — коллагена определяли по уровню маркерной аминокислоты оксипролина.

В результате впервые было установлено, что супероксидный радикал кислорода вызывает повреждение функциональных групп белков ткани склеры в зоне оперативного воздействия (содержание сульфгидрильных и аминогрупп снижалось на 35 и 20 % соответственно, причем уровень дисульфидных связей возрастал на 27 %). Также впервые установлено действие свободнорадикальных форм кислорода, приводящих к повышению уровня оксипролина (химический маркер коллагена) в белках склеры в зоне оперативного вмешательства (об этом свидетельствует повышение скорости биосинтеза коллагена на 33 %).

Кроме того, экспериментально доказано повышение на 73 % антиоксидантной активности и снижение на 40 % уровня малонового диальдегида в слезной жидкости у больных первичной открытоугольной глаукомой при применении эмоксипина. Таким образом, на базе проведенных биохимических исследований, связанных с изучением восстановительного процесса после оперативного вмешательства при первичной открытоугольной глаукоме, была предложена схема медикаментозной коррекции излишнего рубцевания склеры, которая позволила повысить эффективность хирургического лечения больных этим заболеванием на 20 %.

Эндогенный увеит является одним из наиболее тяжелых видов глазной патологии, отличается хроническим рецидивирующим течением, поражает в основном лиц молодого трудоспособного возраста, приводит к слепоте и слабовидению в 8–42 % случаев. Что же касается увеальной катаракты, то в настоящее время отсутствует ее экспериментальная модель, на которой можно было бы изучать патогенез данного заболевания. Несмотря на успехи, достигнутые в современной хирургии катаракт, экстракция увеальной катаракты сопряжена с большими осложнениями как во время операции, так и в послеоперационном периоде, исходы оперативных вмешательств значительно хуже по сравнению с возрастной катарактой.

Поэтому возникает необходимость в определении возможности медикаментозного лечения и профилактики увеальной катаракты.

Для решения сложившейся проблемы нами была впервые создана модель увеальной катаракты путем моделирования аллергического увеита с последующим световым облучением органа зрения экспериментальных животных. При увеальной катаракте в экспериментальных исследованиях была определена взаимосвязь ее пусковых патогенетических механизмов, осуществляемая по типу кокатарактогенеза (когда действие прямого катарактогенного фактора — света усиливается с помощью некатарактогенного фактора — аллергического воспаления).

Впервые при увеальной катаракте были определены различия в уровнях потенциала антиоксидантной системы и соотношении окисленной и восстановленной форм тиоловых соединений по сравнению со световой катарактой и аллергическим экспериментальным увеитом.

Было установлено влияние препарата мексидол (2-этил-6-метил-3-гидрооксипиридина сукцинат), относящегося к группе антигипоксантов и антиоксидантов. Препарат улучшает энергетический обмен клетки, ингибирует свободнорадикальное окисление липидов мембран, связывая перекис­ные радикалы липидов и повышая активность антиоксидантных ферментов, в частности супероксиддисмутазы.

Для углубленного исследования проблемы увеальной катаракты в клинико-лабораторных исследованиях определялась концентрация восстановленной и окисленной форм глутатиона, активность глутатионредуктазы и глутатионпироксидазы. Проводилось это как в эксперименте, так и в клинике (в крови и слезе). Кроме того, определялась перекисная резистентность эритроцитов крови — метаболический статус витамина Е.

При проведении в лаборатории био­химии исследований, основанных на изучении наследственной стромальной дистрофии роговицы, были выявлены нарушения метаболизма, а именно дисбаланс в протеиназно-ингибиторной системе, наиболее существенный при гранулярной дистрофии (повышение активности трипсиноподобных протеиназ на 27,6 % на фоне понижения антитрипсиновой активности на 25,1 %), нарушение окислительно-восстановительных процессов с преобладанием анаэробных процессов (повышение активности лактатдегидрогеназы на 25,3 %), а также снижение стабильности мембран лизосом (увеличение соотношения неседиментируемой активности кислой фосфатазы и катепсина Е и связанной активности этих ферментов в 2 раза).

Также впервые было показано, что выявленные нарушения метаболизма усиливаются при наследственной стро- ­мальной дистрофии роговицы при условии наличия воспалительного компонента.

Кроме того, впервые проведено экспериментальное обоснование применения и изучения эффективности препарата системной энзимотерапии флогэнзим, который существенно снижал воспаление роговицы. Так, выше­указанный препарат ускорял резорбцию воспалительного инфильтрата на 5,2 суток, отек роговицы — на 5,4 суток, экссудата в передней камере — на 4,1 суток. Кроме того, флогэнзим позволял снизить уровень сенсибилизации до антигенов роговицы на 4,7 % и ускорить резорбцию отека транс­плантата на 4,5 суток, а эпителизацию трансплантата — на 1,5 суток.

Кроме того, одним из новых направлений в разработках и экспериментальных исследованиях лаборатории биохимии является получение коллагенового модуля роговичной ткани из человеческой роговицы энуклеированных глаз, изучение механических и светотехнических параметров роговичного матрикса, определение в нем концентрации оксипролина. Проводится эксперимент на животных, связанный с изучением приживаемости имплантатов и дальнейшей судьбы коллагеновых нитей пересаженного матрикса.

Параллельно ведутся работы по созданию искусственной роговицы из человеческого рекомбинантного и свиного коллагена.