Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.

"News of medicine and pharmacy" Акушерство, гинекология, репродуктология (381) 2011 (тематический номер)

Back to issue

Пренатальная экспресс-диагностика методом QF-PCR и автоматического микроэлектрофореза на микрочипах

Authors: В.Н. Запорожан, В.В. Бубнов, В.Г. Маричереда, Т.Г. Вербицкая, О.Б. Белоус, г. Одесса

print version


Summary

Большинство хромосомных аномалий, выявляемых в пренатальных исследованиях, касаются трисомий по 13, 18 или 21-й хромосомам и анеуплоидий половых хромосом, которые связаны с развитием синдромов Патау, Эдвардса, Дауна и Тернера. Пренатальная диагностика повышенного риска хромосомных аномалий осуществляется путем анализа кариотипа культивируемых клеток, причем среднее время анализа составляет 14–21 день. Разработанные технологии, такие как флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) и сравнительная геномная гибридизация (CGH), позволяют провести более быстрый анализ продолжительностью в среднем 2 дня [3, 5, 6]. Однако наиболее распространенная FISH-методика имеет ряд технических недостатков: возможный низкий уровень сигнала, наложение сигнала для различных хромосом, что требует выполнения анализа как минимум в 50–100 анализируемых клетках и наличия высококвалифицированного персонала и дорогостоящих реактивов [3]. Анализ CGH может быть проведен в течение 8–12 часов и позволяет осуществить анализ анеуплоидий по всем хромосомам, однако также имеет высокую себестоимость.

В настоящее время разработан экспресс-анализ, основанный на количественной флюоресцентной полимеразно-цепной реакции (ПЦР) с последующим капиллярным электрофорезом для анализа меченого флюоресцентного продукта — QF-PCR. Этот анализ не требует высоких затрат и выполняется в течение одного рабочего дня. Данная технология предполагает количественное определение микросателлитных аллелей, амплифицированных с использованием меченых праймеров, с последующим разделением по размеру и измерением количества каждой аллели по размеру пика на полуавтоматическом генетическом анализаторе [3].

На основании данной методики были разработаны и применены в пренатальной диагностике стандартные наборы для скрининга [7]. Количество и разнообразие микросателлитных маркеров в этих тестах позволяет надежно отделить нормальный набор хромосом от трисомии, а также исключить мозаицизм и загрязнение пробы материнским генетическим материалом. Как и в большинстве ПЦР-анализов, такой подход позволяет быстро получить результаты, используя минимальные затраты.

С учетом всех имеющихся лабораторных возможностей для пренатальной диагностики нами было предложено применение микросателлитных маркеров изучаемых хромосом для последующего их анализа по размеру и количеству с помощью микрокапиллярного электрофореза на ДНК-микрочипах фирмы BIO-RAD вместо стандартного электрофореза на секвенаторе. Это делает возможным проведения анализа ДНК плода за 4–5 часов, не повышая при этом его себестоимости.

Целью данной работы была модификация метода QF-PCR для использования в экспресс-анализе синдромов Патау, Эдвардса, Дауна и Тернера.

Материалы и методы

Подготовка проб и методика диа­гностики анеуплоидий. Кровь 30 больных с синдромом Дауна и 30 пациентов с нормальным кариотипом отбиралась в пробирки с этилендиаминтетраацетатом объемом 5 мл. Лимфоциты выделяли на градиенте плотности фиколл-верографина. После разделения на градиенте лимфоциты дважды отмывали забуференным физраствором и окрашивали гематоксилин-эозином. Затем лимфоциты разводили титрованием в микропланшетах в среде 199 до состояния, когда концентрация лимфоцитов была 2–10 в 50 мкл, переносили каплю на предметное стекло и отбирали единичные лимфоциты с помощью микроманипулятора, каждый лимфоцит в отдельный стерильный эппендорф (свободные от ДНКаз и РНКаз), содержащий 2 мкл деионизированной воды без ДНКаз. Если анализировали единичные лимфоциты, то предварительно проводили полногеномную амплификацию ДНК с помощью набора Repli-g-Midi kit (Qiagen) согласно методике. После амплификации проверяли концентрацию ДНК в пробе на флюориметре (Nanodrop, USA) с флюоресцентным красителем ДНК SybrGreen. Далее проводили амплификацию специфическими праймерами на микросателиитные маркеры (табл. 1). Реакцию амплификации проводили набором Multiplex PCR kit (Qiagen). Если исходного ДНК было достаточно (концентрация ДНК более 1 нг), сразу выполняли специфическую амплификацию с мечеными праймерами к микросателлитным маркерам.

Продукты амплификации наносили на микрочипы Experion DNA 1К(ВIO-RAD) для анализа ДНК-ампликонов в 1 мкл. Автоматический микроэлектрофорез проводили согласно методике (BIO-RAD) на приборе Experion (BIO-RAD). После электрофореза делали анализ фореграмм с помощью программы обработки данных Experion Software version 2.1.158.0, которая показывает наличие пиков, количество ДНК в каждом пике, высоту пиков, их площадь. Соотношение пиков для диплоидного набора хромосом — 1 : 1–1 : 1,5. Соотношение между пиками больше 1 : 1,5 или наличие трех аллелей для одного маркера говорит о триплодии. Чтобы исключить ошибки, например, при мозаицизме, для каждой хромосомы берется как минимум 2 маркера.

Результаты и обсуждение

Содержание ДНК в пробе после полногеномной амплификации ДНК, выделенной из плодовых эритроцитов, варьировало в пределах 0,03–0,15 мкг/мл. Данное количество геномной ДНК позволяет провести анализ хромосомного набора по изучаемым хромосомам с использованием метода количественной ПЦР с микроэлектрофорезом. Для анализа микросателлитных маркеров мы впервые использовали флуоресцентний микроэлектрофорез на микрочипах, позволяющий использовать микроколичества ДНК в объеме 1 мкл. Как видно на рис. 1, D21S11-маркер показал три пика, что доказывает наличие триплоидии по 21-й хромосоме. Маркер D13S634 показал наличие 2 пиков с соотношением 1 : 1,1, что свидетельствует о диплоидном наборе по 13-й хромосоме (рис. 2). Маркер Dl3S305 при анализе ДНК показал наличие диплоидного набора хромосом. STS-маркер D18S386 также показал наличие диплоидного набора 18-й хромосомы (рис. 3). Определение пола осуществляли по амилогенину и SrY-маркеру (секс-детерминированный регион Y-хромосомы). Загрязнение материала материнской ДНК может быть исключено одновременным анализом материнской ДНК по тем же микросателлитным маркерам. Таким образом, полногеномная амплификация позволяет проводить анализ хромосомных анеуплоидий нескольким клеткам плода.

В нашей работе были использованы маркеры для анализа анеуплоидий 21, 13 и 18-й хромосом.

Выводы

Предложенная модификация метода QF-PCR позволяет идентифицировать хромосомные анеуплоидии плода.

Предложенная модификация метода QF-PCR значительно сокращает продолжительность анализа хромосомных триплоидий до 4 часов без повышения его стоимости.

Метод может быть использован для малоинвазивной пренатальной диагностики по ДНК, выделенной из эритроцитов плода, циркулирующих в крови матери.


Bibliography

1. Alan Н. Handyside, Mark D. Robin­son I, Robert J. Simpson. Isothermal whole genome amplification from single and small numbers of cells: a new era for preimplantationgenetic diagnosis of inherited disease // Molecular Human Reproduction. — 2004. — Vol.10, № 10. — Р. 767-772.

2. Caine A., Maltby A.E., Parkin C.A., Waters J.J., Crolla J.A. Prenatal detection of Down syndrome by rapid aneuploidy testing for chromosomes 13, 18, and 21 by FISH or PCR without a full karyotype: A cytogenetic assessment // Lancet. — 2005. — 366. — 123-128.

3. Kathy Mann, Celia Donaghue, Susan P. Fox, Zoe Docherty and Caroline Mackie Ogilvie. Strategies for the rapid prenatal diagnosis of chromosome aneuploidy // European Journal of Human Genetics. — 2004. — 12. — 907-915.

4. Shaffer L.G., Bui T.-H. Molecular cytogenetic and rapid aneuploidy detection methods in prenatal diagnosis // Am. J. Med. Genet., Part. С. Semin. Med. Genet. — 2007. — 145. — C87-98.

5. Wells D., Escudero T., Levy В. et al. First clinical application of comparative genomic hybridization and polar body testing for preimplantation genetic diagnosis of aneuploidy // Fertil. Steril. — 2002. — 78. — 543-549.

6. Wilton L., Williamson R., McBain J. et al. Birth of a healthy infant after preimplantation confirmation of euploidy by comparative genomic hybridization // N. Engl. J. Med. — 2001. — 345. — 1537-1541.

7. Umberto Nicolini, Faustina Lalatta, Federica Natacci. The introduction of QF-PCR in prenatal diagnosis of fetal aneuploidies: time for reconsideration // Human Reproduction Update. — 2004. — Vol. 10, № 6. — Р. 541-548.

Similar articles

Молекулярный цитогенетический анализ сперматозоидов у бесплодных мужчин методом флюоресцентной гибридизации
Authors: Шамраев С.Н. - Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького; Рутинский А.И. - Украинско-французский медицинский центр репродуктивных функций человека «Семь+Я»; Бабюк И.А. - Институт неотложной и восстановительной хирургии им. В.К. Гусака
"Medical and social problems of family" 3-4 (том 17) 2012
Date: 2013.01.17
Categories: Obstetrics and gynecology
Sections: Clinical researches
Особенности диагностики идиопатического   мужского бесплодия (обзор литературы)
Authors: Рутинский А.И., Научно-исследовательский институт медицинских проблем семьи Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького Украинско-французский центр репродуктивной функции человека «Семь + Я»
"Medical and social problems of family" 1 (том 18) 2013
Date: 2013.04.15
Categories: Obstetrics and gynecology, Investigation methods
Sections: Specialist manual
Генетический профиль семей с нарушением репродуктивной функции
Authors: В.В. Грабарь, Центр репродукции человека «CАНА-МЕД», г. Харьков
"Medical and social problems of family" 1 (том 17) 2012
Date: 2012.04.22
Categories: Obstetrics and gynecology
Sections: Clinical researches
Мужское бесплодие. Генетические аспекты
Authors: Тавокина Л.В. - Молекулярно-цитогенетическая лаборатория Медицинского центра ООО «Исида-IVF», г. Киев
"Kidneys" 2 (08) 2014
Date: 2014.06.02
Categories: Nephrology, Urology
Sections: Specialist manual

Back to issue