Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.

International neurological journal 4(8) 2006

Back to issue

Нейропротективный эффект Церебролизина на тканевой модели ишемии мозга: назначение в постишемический период способствует расширению «терапевтического окна»

Authors: E. Schauer, R. Wronski, B. Hutter-Paier, M. Windisch, JSW-Research, Institute of Experimental Pharmacology, Graz, Austria; J. Patockova, Department of Pharmacology, 3rd Faculty of Medicine, Charles University, Praha, Czech Republic; H. Moessler, E. Doppler, EBEWE Pharma, Unterach, Austria

Categories: Neurology

Sections: Clinical researches

print version


Summary

Все попытки устранить нейрональные повреждения после развития острой ишемии мозга с помощью нейропротекторов не показали положительных результатов в клинической практике. Одной из главных причин этого может быть сравнительно небольшой промежуток времени для медикаментозного вмешательства. В представленном исследовании эффективности применения Церебролизина для выживания нейронов были использованы 2 различные модели ишемии тканевых культур: эксайтотоксического повреждения с применением глутаматной и кислородно-глюкозной депривации (КГД). Церебролизин состоит из пептидов с низкой молекулярной массой, обладающих нейропротективными и нейротрофическими свойствами, аналогичными действию естественных факторов роста нейронов. При обоих видах повреждения применение Церебролизина в определенной дозировке как в остром, так и в отсроченном периоде привело к значительным положительным результатам. На модели эксайтотоксической гибели клеток достоверный эффект препарата отмечался даже тогда, когда лечение начинали спустя 96 часов после добавления глутамата. На модели КГД выраженный эффект отмечался через 48 часов после начала лечения, и даже через 72 часа, хоть и в меньшей степени, но отмечалось выживание поврежденных нейронов. Нейропротективный эффект Церебролизина отмечался до окончания проведения эксперимента и продолжался 2 недели после развития повреждения. При изменении эффективных дозировок выявлено, что при многократном увеличении вводимой дозы усиливается эффективность препарата. Кроме того, полученные результаты свидетельствуют о том, что применение Церебролизина способствует увеличению «терапевтического окна»; это может быть обусловлено совокупностью нейропротективного и нейротрофического действия.


Keywords

Церебролизин, ишемия, культуры тканей, нейроны, апоптоз, некроз.

Введение

Острая ишемия мозга развивается ежегодно у миллионов людей. Ишемический инсульт в структуре смертности стоит на третьем месте и является одной из основных причин инвалидности среди взрослого населения. Неблагоприятные последствия для пациентов в виде утраты способности к самообслуживанию, которая приводит к необходимости в пожизненном уходе, требуют разработки эффективных методов лечения. До сих пор достоверный терапевтический эффект при назначении в первые 3 часа с момента развития инсульта оказывали только тромболитики (Baker, 2005). Потенциальные побочные эффекты этого вида лечения ограничивают круг пациентов, которым можно назначать тромболитики, приблизительно до 5-10% всех случаев развития инсульта (Grotta et al., 2001; Schellinger et al., 2004; Wardlaw et al., 2003). Кроме того, следует учесть, что не у всех пациентов, у которых применяются тромболитики, достигается адекватная реперфузия. Таким образом, в данном исследовании акцентировано внимание на лечении нейропротекторами с целью предотвращения гибели клеток, которая возникает в течение нескольких часов или нескольких дней с момента развития инсульта (Adams, 2001; Devuyst et al., 2001; Sun et al., 1999).

Исходя из патофизиологии ишемии мозга, есть надежда на эффективность различных видов антагонистов глутаматных рецепторов, тем более что при исследованиях на животных получены положительные результаты — значительное снижение объема инфаркта (Ahmed et al., 2000; Katsuta et al., 1995; Prass et al., 1998). Несмотря на многообещающие доклинические данные, ни один из препаратов до сих пор не показал достоверной клинической эффективности при проведении клинических испытаний (Calabresi et al., 2003; Liebeskind et al., 2001). Такой же вывод сделан и для блокаторов кальциевых каналов (Kobayashi et al., 1998). Очевидно, что модели инфарктов у животных имеют низкую клиническую ценность в плане эффективности нейропротекторов (Corbett et al., 1998; deLeciriana et al., 2001). Недостаточную эффективность нейропротекторов в клинической практике нельзя объяснить только относительно коротким временным промежутком для осуществления терапевтического вмешательства. Полученные новые данные свидетельствуют о том, что гибель нервных клеток длится дни или недели с момента развития инсульта (Adams, 2001), с достоверным переходом от острой некротической смерти клеток к апоптозу (Back, 1998). Таким образом, сейчас проводятся исследования новых веществ, блокирующих апоптоз, ингибирующих индуцирование, и препаратов-модуляторов антиапоптозных факторов (Ashwell, 2001; Holcik et al., 2001; Mouw et al., 2002; Waldmeier, 2003; Wiessner et al., 2000). Положительных результатов пока не получено. Неблагоприятным фактором, кроме относительно короткого периода «терапевтического окна», является и тот факт, что терапевтические дозировки препаратов могут не достигать области инфаркта, а также зоны пенумбры. Исследования совместного применения тромболитиков и нейропротекторов, сфокусированные на решении этой проблемы, начаты не так давно (Zhang et al., 2002). Первые полученные данные уже опубликованы, однако весомых доказательств пока не получено.

Накопление знаний о пластичности мозга и возможностях полипотентных стволовых клеток позволяет предположить целесообразность трансплантации аутологичных или гетерологичных стволовых клеток для лечения инсульта или создания препаратов, стимулирующих их пролиферацию и дифференцировку. Данные, полученные при проведении экспериментальных исследований на животных, многообещающи и свидетельствуют о миграции стволовых клеток в нервные окончания, формирующие синапс. Однако до внедрения этой методики в клиническую практику еще далеко (Abe, 2000; Shimazaki, 2003).

Альтернативой является применение естественных факторов роста нейронов или препаратов, стимулирующих их действие. Некоторые из них, например факторы роста фибробластов (FGF-2), показывают многообещающие эффекты в исследованиях на животных, однако клинические испытания FGF-2 не показали убедительных результатов (Abe, 2000; Bethel et al., 1997; Cuevas, 1997; Ferrer et al., 1998, 2001; Jin et al., 2000; Lee et al., 1991; Unoki et al., 1994). Одна из самых больших проблем при использовании факторов роста — их способ введения, поскольку они или в малой степени преодолевают или не преодолевают гематоэнцефалический барьер. С другой стороны, их возможности позволяют оказывать нейропротективный эффект, а также восстанавливающий эффект путем индуцирования нейрональной проводимости и обновления межнейрональных связей или обеспечения пролиферации и дифференцировки стволовых клеток.

Церебролизин — это препарат, созданный по стандартизованным биотехнологическим методикам, состоящий из низкомолекулярных пептидов и аминокислот. Он уже несколько десятков лет применяется для лечения различных неврологических расстройств, включая деменцию, последствия инсультов и мозговых травм. По данным различных публикаций, этот препарат содержит активный фактор роста и способствует выживанию нейронов и улучшению проводимости, так же как это делает естественный фактор роста (NGF) (Satou et al., 2000; Windisch et al, 1993). На различных моделях повреждений мозга добавление Церебролизина к культурам тканей привело к увеличению жизнеспособности нейронов (Gutmann et al., 2002; Hutter-Paier et al., 1996). Все опубликованные данные являются результатом экспериментов, при которых проводилось предварительное лечение за 2 дня до развития повреждения. Во всех исследованиях продемонстрирован протективный эффект при экспериментальном удалении факторов роста, глутаматной эксайтотоксичности, хронической перегрузки кальцием и хронического оксидантного стресса (Hutter-Paier et al., 1996) вследствие добавления к культуре ткани цитрата железа. Более детальные исследования по поводу возможного механизма действия указали на модуляцию активности обеих изоформ кальпаина, одна из которых активируется при низкой, а другая — при высокой концентрации кальция (Wronski et al., 2000). Данные об активности ферментов свидетельствуют о том, что Церебролизин защищает нейроны от потери микротубулярного протеина-2 (МАР-2). По данным исследований, препарат способствует высвобождению МАР-2, что перекликается с данными публикаций о нейротрофической активности.

Опубликованы данные нескольких экспериментов на моделях ишемического инсульта у животных. После двусторонней окклюзии сонных артерий в сочетании со снижением АД применение Церебролизина показало достоверные положительные результаты: уменьшилась смертность в первые 8 часов с момента развития инсульта (Schwab et al., 1997). Это объяснили за счет профилактики отеков, особенно в области ствола мозга. Авторы сообщают, что применение Церебролизина на моделях церебральной ишемии у крыс показало достоверный протективный эффект в отношении МАР-2 (Schwab et al., 1998). В ишемизированном полушарии в контрольных образцах отмечалась почти полная утрата иммунореактивности, тогда как у крыс, которых лечили Церебролизином, иммунореактивность в ипси- и контрлатеральном полушарии была почти одинаковой. Эти данные подтверждают результаты предыдущих экспериментов.

На экспериментальных моделях у крыс было показано, что при двусторонней окклюзии сонных артерий и интраперитонеальной интоксикации цианидом натрия применение Церебролизина интрацеребровентрикулярно нормализует инсультзависимые поведенческие расстройства уже на 4-й день после развития повреждения до контрольного уровня (Gschanes et al., 1997). На моделях окклюзии сонных артерий / реперфузии показано, что Церебролизин предотвращает развитие ключевых изменений (Sugita et al., 1993). Все эти данные свидетельствуют о возможной пользе этого препарата в лечении церебральной ишемии, но недавно опубликованные результаты, полученные в исследованиях на крысах, свидетельствуют о том, что Церебролизин способен стимулировать пролиферацию клеток ствола мозга и их дифференцировку в нейроны (Tatebayashi et al., 2003). Это дает право предполагать, что Церебролизин благодаря своему протективному влиянию на нейроны и обеспечению их выживаемости может стать альтернативой для лечения пациентов с инсультом (Ladurner, 2001). Таким образом, целью экспериментов, проводимых на культуре тканей, была оценка эффекта отсроченного лечения Церебролизином на выживаемость нейронов. Исходя из патомеханизма инсульта, исследование проводилось на 2 различных моделях. Сначала эксайтотоксическое повреждение вызывали путем добавления глутамата в культуру тканей нейронов коры головного мозга цыплят, потому что ранее уже были опубликованы данные о протективном эффекте Церебролизина в домедикаментозном периоде. В качестве второй модели изучали широко распространенный метод кислородной депривации глюкозы. Главной целью было получение данных о влиянии отсроченного лечения Церебролизином на выживаемость нейронов.

Материалы и методы

Первичная культура нейронов конечного мозга цыплят

Первичная культура нейронов получена от 8-дневного эмбриона ломанской коричневой курицы (Pettmann et al., 1979). Клетки сохранялись в минимальной концентрации вещества (DMEM, Cambrex), с добавлением 5% сыворотки Nu (Becton Dickinson), 2 мМ глутамата (Bio Whittaker) и 0,1 мг/мл гентамицина (Cambrex). Эксперименты были поставлены на 96 образцах.

Глутаматное повреждение

L-глутаматное повреждение осуществлялось на 3-й день in vitro путем добавления 10 m л раствора глутамата в каждый образец (кроме неповрежденных контрольных) до получения концентрации 1 мМ. Токсическое вещество оставалось в клетках 24 часа. До, во время и после повреждения клетки находились в инкубаторе при температуре 37°С, при влажности 95% и 5% СО2.

Лечение и оценка состояния поврежденных глутаматом образцов

Церебролизин добавляли к образцам на 5-й день in vitro (24-часовое окно) и на 8-й день (96-часовое окно). Оценку жизнеспособности клеток проводили на 7, 9, 11 и 14-й дни (24-часовое окно) и на 9, 11, 14 и 17-й дни (96-часовое окно).

Кислородо-глюкозная депривация (КГД)

На 3-й день in vitro препарат был заменен неглюкозосодержащим DMEM и образцы были помещены в КГД-камеры, которые были очищены 70% этанолом и проверены на герметичность перед использованием. Две чашки Петри, наполненные водой до нижнего уровня, применялись для обеспечения достаточного уровня влажности. После закрытия камера была наполнена газовой смесью, содержащей 95% N2 и 5% CO2, со скоростью потока 25 л в минуту, и герметично закрыта. Далее камера была помещена в инкубатор при температуре 37°С. 45 минут спустя камера снова наполнялась газовой смесью на протяжении 2 минут при такой же скорости, чтобы окончательно убрать кислород. Камера снова помещалась в инкубатор при температуре 37°С на оставшийся период для окончания процесса повреждения. В целом период повреждения составил 24 часа.

Сохранение клеток в восстановительном периоде

После повреждения препарат был заменен EMEM с 1 г глюкозы/1,2 % FCS, 0,01% гентамицин сульфата и 2 мM L-глутамата. До конца эксперимента образцы хранились в инкубаторе при температуре 37°С, 95% влажности и 5% СО2.

Лечение и оценка состояния культуры тканей, подвергшейся КГД

Во время первого этапа эксперимента КГД была произведена на 3-й день in vitro, тогда как ММТ-тест был произведен спустя 24 часа после добавления Церебролизина. Церебролизин был добавлен на 3-й день (во время повреждения), на 4, 5 и 6-й дни in vitro.

Во время второго этапа эксперимента Церебролизин добавляли непосредственно сразу после повреждения (4-й день in vitro). Оценивали состояние тканей на 8, 10, 12 и 15-й дни in vitro.

Статистика

Для получения данных и статистического анализа была использована программа Statistica 99, Statsoft Inc., USA. Для определения уровня достоверности и возможности ошибки менее чем на 5% использовался тест Newman — Keuls.

Результаты

После 24-часовой экспозиции в L-глутамате почти 2/3 нейронов погибли в течение последующих 4 дней. Применение Церебролизина через 24 часа после повреждения показало достоверное увеличение числа дееспособных нейронов (р < 0,05), когда дееспособность определялась на 4-й день после повреждения. Нейропротективный эффект являлся дозозависимым, и при применении 80 μл Церебролизина на 1 мл образца культуры ткани число дееспособных нейронов увеличилось почти вдвое (р < 0,001). Через 6 дней после развития поражения отмечали достоверное уменьшение числа выживших нейронов (р < 0,001), но в то же время продолжал проявляться церебропротективный эффект препарата (р < 0,05) при его дозировке 10 μл на 1 мл образца; наибольший эффект показан при дозировке 80 μл на 1 мл (р < 0,001; эта дозировка практически препятствует дальнейшей гибели клеток). Жизнеспособность нейронов через 8 дней от момента повреждения показывает, что существует дальнейшее уменьшение нейрональных повреждений в контрольной группе (р < 0,05), а в группе Церебролизина снова отмечалась зависимость степени нейропротективности от дозировки с достоверным улучшением жизнеспособности нейронов при дозировке от 10 до 160 μл на 1 мл. Последняя оценка жизнеспособности нейронов проводилась на 11-й день после повреждения. Продемонстрировано отсутствие дальнейшего уменьшения жизнеспособных нейронов, и на этой стадии Церебролизин проявлял нейропротективные свойства в дозировке 40, 80 и 160 μл на 1 мл (р < 0,01). Самая высокая дозировка увеличивала жизнеспособность клеток почти в 3 раза по сравнению с контрольной группой.

Во второй серии экспериментов лечение Церебролизином начинали через 96 часов после развития повреждения. Первую оценку жизнеспособности клеток проводили через 6 дней после повреждения, через 2 дня после использования препарата. Дозировка 10 μл на 1 мл образца привела к достоверному увеличению жизнеспособности нейронов, а протективный эффект тоже был дозозависимым и наиболее выраженным при применении дозировки 80 и 160 m л на 1 мл. Оценка количества выживших нейронов через 8 дней после развития повреждения показала достоверное продолжение процесса гибели клеток (р < 0,01), а эффекты Церебролизина были такими же, как и ранее. При дальнейшей оценке жизнеспособности клеток на 11-й и 14-й дни с момента повреждения зафиксировано незначительное, но достоверное уменьшение числа жизнеспособных нейронов. При раннем и позднем назначении Церебролизина выявлены достоверные нейропротективные свойства препарата в дозе от 5 до 160 μл на 1 мл, а при оценке на 14-й день после развития повреждения — в дозе от 10 до 160 μл на 1 мл.

При самых высоких дозах (80 и 160 μл) количество клеток практически не изменялось на протяжении всего эксперимента. При небольших дозах количество нейронов уменьшалось, хотя наблюдался нейропротективный эффект препарата.

В дальнейшей серии экспериментов была использована модель КГД для имитации ишемии мозга. Такое нарушение приводило к достоверному сокращению количества жизнеспособных нейронов в условиях контроля. В отличие от глутаматного повреждения здесь не наблюдалась гибель клеток в промежутке между 24 и 72 часами после повреждения. Назначение Церебролизина сразу после развития повреждения, через 24, 48 и 72 часа во всех случаях оказывало нейропротективный эффект, указывая, по меньшей мере, на 72-часовое «терапевтическое окно» для Церебролизина в данном случае. Однако наиболее выраженный эффект наблюдался при лечении, начавшемся сразу с реоксигенации: достоверно (р < 0,05) увеличивалось количество нейронов уже при дозировке 20 μл на 1 мл, а максимальный эффект достигался при 40 μл на 1 мл (р < 0,001). Подобный эффект наблюдался при дозировках 80 и 160 μл на 1 мл. Задержка в назначении препарата на 48 часов приводила к меньшей его эффективности, и первые ощутимые результаты появлялись только при дозе 80 и 160 μл на 1 мл (р < 0,001). Когда лечение начиналось с задержкой в 72 часа, наблюдали менее выраженный эффект: нейропротективные свойства отмечались при использовании дозировки от 20 до 160 μл. Выраженный нейропротективный эффект отмечался только в дозировке 160 μл на 1 мл (р > 0,05). Чтобы получить больше информации о длительности действия Церебролизина после развития повреждения, снова была взята модель КГД. Все культуры получили лечение препаратом сразу после окончания 24-часового гипоксического периода, оценку жизнеспособности нейронов проводили через 4, 6, 8 и 11 дней спустя. При оценке эффективности лечения спустя 4 дня после повреждения отмечался достоверный нейропротективный эффект дозировки Церебролизина 5 и 10 μл на 1 мл с наиболее высоким показателем эффективности при применении дозировки 5 мкл на 1 мл. Применение более высоких доз не давало значительных результатов, хотя отмечалось их влияние на жизнеспособность нейронов. Доза в 160 μл даже уменьшала количество выживших нейронов (р < 0,001). 6 дней спустя после КГД сохранялся достоверный протективный эффект препарата при дозировке от 5 до 160 μл на 1 мл (от р < 0,05 до р < 0,001). Оценка состояния на 8-й день после повреждения показала достоверную эффективность Церебролизина в дозировке от 5 до 160 μл в предотвращении гибели клеток (от р < 0,05 до р < 0,001). При оценке состояния спустя 11 дней после КГО достоверное нейропротективное действие Церебролизина отмечалось в дозе от 40 до 160 μл на 1 мл (от р < 0,05 до р < 0,01). В целом все данные свидетельствуют о проявлении нейропротективных свойств Церебролизина даже в случае начала его применения через 96 часов после развития повреждения ткани мозга. Продолжение гибели клеток после развития ишемии говорит о том, что для сохранения как можно большего количества клеток лечение нейропротектором нужно начинать как можно раньше.

Обсуждение

Применение нейропротекторов при ишемическом инсульте поможет свести к минимуму гибель нейронов и уменьшить объем поврежденной зоны мозга (Fisher et al., 2003). На сегодня это является важным терапевтическим шагом для достижения реперфузии инфарктной зоны мозга в течение малого временного периода, вследствие чего улучшатся клинические результаты (Abboud et al., 2004). На сегодняшний день тромболизис проводят немногим пациентам, и его эффект не всегда удовлетворителен (Svoboda, 2005). Поэтому на нейропротективную терапию в таких ситуациях возлагаются особые надежды. Многие препараты, показавшие многообещающий эффект в эксперименте, на практике оказались непригодны (Goldstein, 2004; Wahlgen et al., 2004).

Исследуемый препарат Церебролизин показал способность поддерживать функцию нейронов и оказывать нейропротективное действие in vivo и in vitro (Windisch et al., 1998). Препарат показал достоверный дозозависимый протективный эффект в нескольких моделях ишемии в тканевых культурах, вызванных интоксикацией цианатом натрия, повреждением йодоацетатом или эксайтотоксическим повреждением при использовании глутамата или NMDA (Gutmann et al., 2002; Hutter-Paier et al., 1996, 1998). Все эти эксперименты проводились при предварительном лечении на протяжении нескольких дней перед развитием ишемии. В этих исследованиях жизнеспособность клеток увеличивалась, а также возрастал уровень нейропротекции (Hartbauer et al., 2001), что объяснялось препятствием потери МАР-2 (Hutter-Paier et al., 2000). Это объяснялось присутствием фактора роста и возможным увеличением белкового синтеза (Piswanger et al., 1990). Отмечались также дополнительные эффекты (Wronski et al., 2000), поэтому общий эффект, вероятно, обусловлен непосредственным подавлением механизмов некротической гибели клеток, а также апоптозом (Hartbauer et al., 2001).

Но до настоящего времени это исследование является единственным, демонстрирующим протективные свойства Церебролизина при отсроченном применении препарата после развития ишемии. Предполагалось, что во время первых 24 часов после ишемии преобладает некротическая гибель клеток, а затем ее сменяет апоптоз, который продолжается от нескольких дней до нескольких недель (Back et al., 2004; Hu et al., 2002). В глутаматной модели применение препарата через 24 часа после начала симптоматики показывает достоверную нейропротекцию во всех дозировках при проведении оценки состояния через 4 дня. С увеличением временного промежутка между повреждением и проведением оценки жизнеспособности нейронов нейропротективная активность проявляется при назначении более высоких концентраций препарата, но до 6-го дня наиболее эффективная дозировка препятствует дальнейшему уменьшению количества нейронов по сравнению с контрольной группой. Следует отметить, что даже на 11-й день после повреждения выживаемость клеток в группе, где использовалась самая высокая дозировка, в три раза выше, чем в контрольной группе. Эти данные указывают на то, что Церебролизин эффективен в период апоптотической фазы смерти клеток, при этом некоторые из активных компонентов со временем перестают действовать. Поэтому необходим переход от более низких дозировок препарата к более высоким. Можно предположить, что различные компоненты этого комплексного препарата действуют на разных фазах развития повреждения. При назначении Церебролизина через 96 часов после развития ишемии, вызванной L-глутаматным повреждением, отмечается нейропротективный эффект. Общий уровень жизнеспособности нейронов ниже, что свидетельствует о гибели большого числа клеток в период между 4-м и 6-м днем после повреждения. При контрольных условиях жизнеспособность нейронов снижается вплоть до 8-го дня, тогда как даже малая дозировка Церебролизина способна до определенного уровня препятствовать прогрессирующей смерти клеток. Высокие дозы Церебролизина полностью предотвращают гибель клеток до 2 недель после повреждения. Такого длительного нейропротективного действия не наблюдалось ни у одного препарата. До сегодняшнего дня не были опубликованы результаты каких-либо исследований, свидетельствующие об эффективности отдаленного применения какого бы то ни было препарата с нейропротективными свойствами. Большинство экспериментов свидетельствуют лишь об эффективности до 24 или 48 часов после повреждения. Некоторые исследования выявляют эффективность NMDA-антагонистов только в случае применения препарата до развития или в момент развития инсульта (Kaku et al., 1991; Rootwelt et al., 1998). Есть также исследования, доказывающие, что отсроченное применение каких-либо составляющих, типа МК-801, дает возможность сохранить нейроны, поврежденные вследствие эксайтотоксичности (Vornov et al., 1994). При глутаматном повреждении наиболее эффективной является защита от свободных радикалов, поскольку поглотитель радикалов проявляет защитные свойства в течение 48 часов (Porciuncula et al., 2001). Это соответствует данным об эффективности витаминов Е и С при глутаматном повреждении (Ciani et al., 1996). При объяснении эффективности Церебролизина могут быть полезны данные исследований с применением других факторов роста. Известно, что TGF-β1 стабилизирует кальциевый гомеостаз после ишемического повреждения in vitro (Krieglstein, 1997), а также известно об активности, зависящей от нейротрофических факторов (ADNF), и производных, демонстрирующих нейропротективные свойства (Glazner et al., 1999; Gozes et al., 2000). Поскольку Церебролизин содержит различные низкомолекулярные пептиды, то существует предположение, что эффективность известных нейропептидов сымитирована. Например, эффект VIP, который действует посредством снижения ADNF (Shoge et al., 1998; Sigalov et al., 2000), или эффект от различных опиоидных пептидов, которые могут предотвратить гибель нейронов посредством дельта-опиоидных рецепторов (Zhang et al., 2000).

В представляемом исследовании использован 2-й тип ишемии — кислородно-глюкозный. Церебролизин способствовал сохранению нейронов как при применении непосредственно во время повреждения, так и с задержкой до 72 часов. Назначение Церебролизина через 24 часа после КГД увеличивало жизнеспособность нейронов почти на 50%, подобный эффект наблюдался также при применении спустя 48 и 72 часа соответственно, но требовалось увеличение дозы. На втором этапе экспериментов Церебролизин назначали через 24 часа после КГД, жизнеспособность нейронов исследовалась на 4, 6, 8 и 11-й дни после повреждения. При каждой оценке наблюдался достоверный нейропротективный эффект при уже упомянутом изменении дозы. Даже при повышении концентрации препарата наблюдалась дальнейшая утрата жизнеспособности нейронов, но в сравнении с контрольной группой количество выживших нейронов было больше практически на 50%. Отмечено, что при КГД нейропротективный эффект менее выражен, чем при глутаматном повреждении. Это объясняется тем, что эксайтотоксичность является только одной стороной ишемии, тогда как КГД вызывает изменения от полного разрушения энергетического обмена веществ до создания условий для развития ишемии мозга. Были исследованы также другие компоненты в этой модели. Ингибиторы полимеразы (ADP-рибоза) обладают защитными свойствами in vitro только в долечебном периоде, но те же составляющие (PJ34) проявляют эффект также при закупорке / перфузии средней церебральной артерии у крыс при их применении после развития ишемии (Abdelkarim et al., 2001). Ингибиторы MAO-B, такие как селегилин и разагилин, защищают клетки РС12 или SHSY5Y-клетки при КГД. Предложенный механизм действия представляет собой нечто среднее между уменьшением bcl-2, антиапоптическим фактором и активацией протеинкиназы С, а также регулированием проапоптотических протеинов FAS и Bax-типа (Abu-Raya et al., 2002; Yodim et al., 2005). Введение антиоксидантов оказало протективное действие при гипоксии / ишемии (Guo et al., 2000). Однако было также отмечено, что при ишемии, вызванной КГД, исследуемые препараты выполняли нейропротективную функцию только в долечебном периоде применения. Лишь относительно небольшое количество компонентов выполняют защитную функцию при отсроченном их применении, например производные изохинолинона (Chiarugi et al., 2003). Тем не менее это первое исследование по изучению действия препарата в период более 2 недель. Ранее указанные ингибиторы МАО-В не проявляют нейропротективного эффекта спустя 2-3 дня после аноксического / гипогликемического повреждения, но они достоверно эффективны в первые 24 часа (Ekblom et al., 1998). Также есть сведения о наличии нескольких факторов роста и компонентов факторов роста, имеющих антиишемический эффект (Guo et al., 2000; Kusumoto et al., 1997). Их механизм действия до сих пор не аргументирован, однако уже существует несколько опубликованных исследований по этому поводу. Сосудистый эндотелиальный фактор роста оказывает защитное действие путем Akt- и Nf-kappaB-прохождения (Jin et al., 2001). TGF-β1, как было указано выше, стабилизирует внутриклеточный кальциевый гомеостаз. Инсулин и инсулиноподобный фактор роста влияют на плотность ГАМК-A-рецепторов (Mielke et al., 2005). Фактор роста нервов (ФРН), производный пептидов, включает транскрипционные факторы, которые стимулируют экспрессию нейропротективных протеинов (Guo et al., 2000). Пептиды NGF и BDNF нормализуют высокий уровень внутриклеточного кальция, а также увеличивают в 60 раз активность транскрипционного фактора АР-1 (Shashoua et al., 2003). Вазоактивный интестинальный полипептид, действующий посредством ADNF, активирует сАМФ-зависящие пути и протеинкиназу А (Sigalov et al., 2000). Некоторые из этих механизмов, возможно, помогут объяснить выраженный эффект Церебролизина. В обоих исследуемых типах ишемии влияние Церебролизина на МАР-2 может быть частью защитного механизма (Hutter-Paier et al., 2000; Wronski et al., 2000). До сих пор неизвестно, способен ли Церебролизин увеличивать экспрессию антиапоптотических факторов. Но этот препарат выявляет активность при всех типах ишемии. Эффективность препарата проявлялась в уменьшении общей смертности, в практически абсолютном препятствии потери МАР-2 (Schwab et al., 1997, 1998), блокировании образования свободных радикалов (Sugita et al., 1993) и, наконец, в быстром и полном восстановлении неврологического дефицита (Gschanes et al., 1997). Благодаря комплексному составу Церебролизина, большинство синергических эффектов его компонентов оказывают в сумме нейропротективное действие. Такие эффекты достоверно могут способствовать лучшему восстановлению после инсульта. На данный момент сложно сделать определенные выводы о потенциальной клинической эффективности из экспериментальных исследований. Но для Церебролизина уже получены клинические данные, свидетельствующие о его терапевтической эффективности при ишемическом инсульте (Barolin et al., 1996; Ladurner et al., 2005).


Bibliography

1. Abboud H., Amarenco P. Thrombolysis and acute stroke // MS-Med Sci, 2004; 20: 1104-1108.

2. Abdelkarim G.E., Gertz K., Harms C., Katchanov J., Dirnagl U., Szabo C., Endres M. Protective effects of PJ34, a novel, potent inhibitor of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) in in vitro and in vivo models of stroke // Int. J. Mol. Med., 2001: 255-260.

3. Abe K. Therapeutic potential of neurotrophic factors and neural stem cells against ischemic brain injury // J. Cerebr. Blood. F. Met., 2000; 20: 1393-1408.

4. Abu-Raya S., Tabakman R., Blaugrund E., Trembovler V., Lazarovici P. Neuroprotective and neuro-toxic effects of monoamine oxidase-B inhibitors and derived metabolites under ischemia in PC 12 cells // Ear. J. Pharmacol., 2002; 434: 109-116.

5. Adams H.P. Treatment of acute ischemic stroke: selecting the right treatment for the right patient // Eur. Neurol., 2001; 45: 61-66.

6. Ahmed N., Nasman P., Wahlgren N.G. Effect of intravenous nimodipine on blood pressure and outcome after acute stroke // Stroke, 2000; 31: 1250-1255.

7. Ashwell S. Caspases: recent advances in small molecule inhibitors // Expert Opin Ther Pat, 2001; 11: 1593-1603.

8. Back T. Pathophysiology of the ischemic penumbra — revision of a concept // Cell Mol Neurobiol., 1998; 18: 621-638.

9. Back T., Schuler O.G. The natural course of lesion development in brain ischemia // Acta Neurochir, 2004; 89: 55-61.

10. Baker W.E. Thrombolytic therapy: current clinical practice // Hematol. Oncol. Clin., 2005; 19: 147-181.

11. Barolin G.S., Koppi S., Kapeller E. Old and new aspects of stroke treatment with emphasis on meta-bolically active medication and rehabilitative outcome // Euro Rehab, 1996; 3: 135-143.

12. Bastianetto S., Zheng W.H., Quirion R. The Ginkgo biloba extract (EGb 761) protects and rescues hippocampal cells against nitric oxide-induced toxicity: involvement of its flavonoid constituents and protein kinase C // J. Neurochem., 2000; 74: 2268-2277.

13. Bethel A., Kirsch J.R., Koehler R.C., Finklestein S.P., Traystman R.J. Intravenous basic fibroblast growth factor decreases brain injury resulting from focal ischemia in cats // Stroke, 1997; 28: 609-616.

14. Calabresi P., Centonze D., Cupini L.M., Costa C., Pisani F., Bernard G. lonotropic glutamate receptors: still a target for neuroprotection in brain ischemia? Insights from in vitro studies // Neurobiol Dis, 2003; 12: 82-88.

15. Chandrasekaran K., Mehrabian Z., Spinnewyn B., Chinopoulos C., Drieu K., Fiskum G. Neuroprotective effects of bilobalide, a component of Ginkgo biloba extract (EGb 761(R)) in global brain ischemia and in excitotoxicity-induced neuronal death // Pharmacopsychiatry, 2003; 36: S. 89-94.

16. Chiarugi A., Meli E., Calvani M., Picca R., Baronti R., Camaioni E., Costantino G., Marinozzi M., Pellegrini-Giampietro D.E., Pellicciari R., Moroni F. Novel isoquinolinone-derived inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase-1: pharmacological characterization and neuroprotective effects in an in vitro model of cerebral ischemia // J. Pharmacol. Exp. Ther., 2003; 305: 943-949.

17. Ciani E., Groneng L., Voltattorni M., Rolseth V., Contestabile A., Paulsen R.E. Inhibition of free radical production of free radical scavenging protects from the excitotoxic cell death medicated by glutamate in cultures of cerebellar granule neurons // Brain Res, 1996; 728: 1-6.

18. Corbett D., Nurse S. The problem of assessing effective neuroprotection in experimental cerebral ischemia // Prog. Neurobiol., 1998; 54: 531-548.

19. Cuevas P. Therapeutic prospects for fibroblast growth factor treatment of brain ischemia // Neurol. Res., 1997; 19: 355-356.

20. deLecifiana M.A., Diez-Tejedor E., Carcller F., Roda J.M. Cerebral ischemia: from animal studies to clinical practice. Should the methods be reviewed? // Cerebrovasc Dis, 2001; 11: 20-30.

21. Devuyst G., Bogousslavsky J. Recent progress in drug treatment for acute ischemic stroke // Cerebrovasc Dis, 2001; 11: 71-79.

22. Ekblom J., Garpenstrand H., Tottmar O., Prince J.A. A cell culture model of cerebral ischemia as a convenient system to screen for neuroprotective drugs // J. Neural. Transm., 1998; 52: 93-98.

23. Ferrer I., Ballabriga J., Marti E., Perez E., Alberch J., Arenas E. BDNF up-regulates TrkB protein and prevents the death of CA1 neurons following transient forebrain ischemia // Brain Pathol., 1998; 8: 253-261.

24. Ferrer L., Krupinski J., Goutan E., Marti E., Ambrosio S., Arenas E. Brain-derived neurotrophic factor reduces cortical cell death by ischemia after middle cerebral artery occlusion in the rat // Acta Neuropathol., 2001; 101: 229-238.

25. Fisher M., Ratan R. New perspectives on developing acute stroke therapy // Ann Neurol., 2003; 53: 10-20.

26. Glazner G.W., Boland F., Dresse A.E., Brennemann D.E., Gozes L., Mattson M.P. Activity-dependent neurotrophic factor peptide (ADNF9) protects neurons against oxidative stress-induced death // J. Neurochem., 1999; 73: 2341-2347.

27. Goldstein L.B. Neuroprotective therapy for acute ischaemic stroke: down, but not out // Lancet, 2004; 363: 414-415.

28. Gozes I., Brenneman D.E. A new concept in the pharmacology of neuroprotection // J. Mol. Neurosci., 2000; 14: 61-68.

29. Grotta J.C., Burgin W.S., El Mitwalli A., Long M., Campbell M., Morgenstern L.B., Malkoff M., Alexandrov A.V. Intravenous tissue-type plas-minogen activator therapy for ischemic stroke -Houston experience 1996 to 2000 // Arch Neurol., 2001; 58: 2009-2013.

30. Gschanes A., Valouskova V., Windisch M. Ameliorative influence of a nootropic drug on motor activity of rats after bilateral carotid artery occlusion // J. Neural. Transm., 1997; 104: 1319-1327.

31. Quo Z.H., Mattson M.P. Neurotrophic factors protect cortical synaptic terminals against amyloid-and oxidative stress-induced impairment of glucose transport, glutamate transport and mitochondrial function // Cereb. Cortex, 2000; 10: 50-57.

32. Gutmann B., Hutter-Paier B., Skofitsch G., Windisch M., Gmeinbauer R. In vitro models of brain ischemia: the peptidergic drug cerebrolysin protects cultured chick cortical neurons from cell death // Neurotox Res., 2002; 4: 59-65.

33. Hartbauer M., Hutter-Paier B., Skofitsch G., Windisch M. Antiapoptotic effects of the peptidergic drug Cerebrolysin on primary cultures of embryonic chick cortical neurons // J. Neural. Transm., 200l; 108: 459-473.

34. Hartbauer M., Hutter-Paier B., Windisch M. Effects of Cerebrolysin on the outgrowth and protection of processes of cultured brain neurons // J. Neural. Transm., 2001; 108: 581-592.

35. Holcik M., Gibson H., Korneluk R.G. XIAP: apoptotic brake and promising therapeutic target // Apoptosis, 2001; 6: 253-261.

36. Hu X.L., Johansson I.M., Brannstrom T., Olsson T., Wester P. Long-lasting neuronal apoptotic cell death in regions with severe ischemia after photothrom-botic ring stroke in rats // Acta Neuropalhol, 2002; 104: 462-470.

37. Hutter-Paier B., Grygar E., Loibner M., Skofitsch G., Windisch M. Effects of NaCN and ionomy-cin on neuronal viability and on the abundance of microtubulc-associated proteins MAPI, MAP2, and tau in isolated chick cortical neurons // Cell Tissue Res, 2000; 302: 39-47.

38. Hutter-Paier B., Grygar E., Windisch M. Death of cultured telencephalon neurons induced by glutamate is reduced by the peptide derivative Cerebrolysin // J. Neural. Transm., 1996; 47: 267-273.

39. Hutter-Paier B., Steiner E., Windisch M. Cerebrolysin protects isolated cortical neurons from neurodegeneration after brief histotoxic hypoxia // J. Neural. Transm., 1998; 53: 351-361.

40. Jin K., Mao X.O., Batteur S.P., McEachron E., Leahy A., Greenberg D.A. Caspase-3 and the regulation of hypoxic neuronal death by vascular endothelial growth factor // Neuroscience, 2001; 108: 351-358.

41. Jin K.L., Mao X.O., Greenberg D.A. Vascular endothelial growth factor: direct neuroprotective effect in in vitro ischemia // PNAS 97, 2000: 10242-10247.

42. Kaku D.A., Goldberg M., Choi D. Antagonism of non-NMDA receptors augments the neuroprotective effect of NMDA receptor blockade in cortical cultures subjected to prolonged deprivation of oxygen and glucose // Brain. Res 1991; 554: 344-347.

43. Katsuta K.K., Nakanishi H., Shirakawa K., Yoshida K., Takagi K., Tamura A. The neuroprotective effect of the novel non competitive NMDA antagonist, FR115427 in focal cerebral ischemia in rats // J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 1995; 15: 345-348.

44. Kobayashi T., Mori Y. Ca2+ channel antagonists and neuroprotection from cerebral ischemia // Eur. J. Pharmacol., 1998; 363: 1-15.

45. Krieglstein J. Excitotoxicity and neuroprotection // Eur. J. Pharm. Sci, 1997; 5: 181-187.

46. Kusumoto M., Dux E., Hossmann K.A. Effect of trophic factors on delayed neuronal death induced by in vitro ischemia in cultivated hippocampal and cortical neurons // Metab. Brain. Dis, 1997; 12: 113-120.

47. Ladurner G. Neuroprotection in acute ischaemic stroke // Stroke, 2001; 32: 1.

48. Ladurner G., Kalvach P., Moessler H. Neuroprotective treatment with Cerebrolysin in patients with acute stroke: a randomised controlled trial // J. Neural. Transm., 2005; 112: 415-428.

49. Lee W., Bondy C. Insulin-like growth factors and cerebral ischemia // Ann. NY Acad Sci, 1991; 1993: 418-422.

50. Lesage A.S., De Loore K.L., Peeters L., Leyesen Je. Neuroprotective sigma ligands interfere with the glutamate-activated NOS pathway in hippocampal cell culture // Synapse, 1995; 20: 156-164.

51. Liebeskind D.S., Kasner S.E. Neuroprotection for ischaemic stroke — an unattainable goal? // CNS Drugs, 2001; 15: 165-174.

52. Mielke J.G., Wang Y.T. Insulin exerts neuroprotection by counteracting the decrease in cell-surface GABA(A) receptors following oxygen-glucose deprivation in cultured cortical neurons // J. Neurochem., 2005; 92: 103-113.

53. Mouw G., Zechel J.L., Zhou Y., Lust W.D., Selman W.R., Ratcheson R.A. Caspase-9 inhibition after focal cerebral ischemia improves outcome following reversible focal ischemia // Metab. Brain. Dis, 2002; 17: 143-151.

54. Nakazawa M., Matsuno K., Mita S. Activation of sigma(l) receptor subtype leads to neuroprotection in the rat primary neuronal cultures // Neurochem. Int. 1998; 32: 337-343.

55. Pettmann B., Louis J., Sensenbrenner M. Morphological and biochemical maturation of neurones cultured in the absence of glial cells // Nature, 1979; 281: 378-380.

56. Piswanger A., Paier B., Windisch M. Modulation of protein synthesis in a cell-free system from rat brain by Cerebrolysin during development and aging // Amino acids: chemistry, biology and medicine. — Escom, Leiden, 1990; pp. 651-657.

57. Porciuncula L.O., Rocha J.B.T., Boeck C.R., Vendite D., Souza D.O. Ebselen prevents excitotoxicity provoked by glutamate in rat cerebellar granule neurons // Neurosci Lett, 2001; 299: 217-220.

58. Prass K., Dirnagl U. Glutamate antagonists in therapy of stroke // Restor. Neurol. Neuros., 1998; 13: 3-10.

59. Rootwelt T., Dunn M., Yudkoff M., Itoh T., Almaas R., Pleasure D. Hypoxic cell death in human NT2-N neurons: involvement of NMDA and non-NMDA glutamate receptors // J. Neurochem., 1998; 71: 1544-1553.

60. Satou T., Itoh T., Tamai Y., Ohde H., Anderson A.J., Hashimoto S. Neurotrophic effects of FPF-1070 (Cerebrolysin) on cultured neurons from chicken embryo dorsal root ganglia, ciliary ganglia, and sympathetic trunks // J. Neural. Transm., 2000; 107: 1253-1262.

61. Schellinger P.D., Kaste M., Hacke W. An update on mrombolytic therapy for acute stroke // Curr. Opin. Neurol., 2004; 17: 69-77.

62. Schwab M., Antonow-Schlorke I., Zwiener U., Bauer R. Brain-derived peptides reduce the size of cerebral infarction and loss of MAP2 immuno-rcactivity after focal ischemia in rats // J. Neural. Transm., 1998; 53: 299-311.

63. Schwab M., Schaller R., Bauer R., Zwiener U. Morphofunctional effects of moderate forebrain ischemia combined with short-term hypoxia in rats — protective effects of Cerebrolysin // Exp. Toxicol. Pathol., 1997; 49: 29-37.

64. Shashoua V.E., Adams D.S., Boyer-Boiteau A., Cornell-Bell A., Li F.H., Fisher M. Neuroprotective effects of a new synthetic peptide, CMX-9236, in in vitro and in vivo models of cerebral ischemia // Brain Res, 2003; 963: 214-223.

65. Shimazaki T. Biology and clinical application of neural stem cells // Horm Res, 2003; 60: 1-9.

66. Shoge K., Mishima H.K., Saitoh T., Ishihara K., Tamura Y., Shiomi H., Sasa M. Protective effects of vasoactive intestinal peptide against delayed glutamate neurotoxicity in cultured retina // Brain. Res, 1998; 809: 127-136.

67. Sigalov E., Fridkin M., Brenneman D.E., Gozes I. VIP-related protection against iodoacetate toxicity in pheochromocytoma (PC12) cells // J. Mol. Neurosci., 2000; 15: 147-154.

68. Sugita Y., Kondo T., Kanazawa A., Itou T., Mizuno Y. Protective effect of FPF (Cerebrolysin) on delayed neuronal death in the gerbil — detection of hydroxyl radicals with salicylic acid // Brain. Nerve, 1993; 45: 325-331.

69. Sun A.Y., Cheng J.H. Novel targets for therapeutic intervention against ischemic brain injury // Clin. Neuropharmacol., 1999; 22: 164-171.

70. Svoboda J.J. Thrombolysis for acute stroke // JAMA, 2005; 293: 421-422.

71. Tatebayashi Y., Lee M.H., Li L., Iqbal K., Grundke-Iqbal I. The dentate gyrus neurogenesis: a therapeutic target for Alzheimer's disease // Acta Neuro-pathol., 2003; 105: 225-232.

72. Unoki K., La vail M. Protection of the rat retina from ischemic injury by brain-derived neurotrophic factor, ciliary neurotrophic factor, and basic fibro-blast growth factor // Invest. Ophtalmol. Vis. Sci, 1994; 35: 907-915.

73. Vornov J.J., Tasker R.C., Coyle J.T. Delayed protection by MK-801 and tetrodotoxin in a rat orga-notypic hippocampal culture model of ischemia // Stroke, 1994; 25: 457-465.

74. Wahlgren N.G., Ahmed N. Neuroprotection in cerebral ischaemia: facts and fancies — the need for new approaches // Cerebrovasc Dis, 2004; 17: 153-166.

75. Waldmeier P.C. Prospects for antiapoptotic drug therapy of neurodegenerative diseases // Prog Neuropsychopath, 2003; 27: 303-321.

76. Wardlaw J.M., Sandercock P.A.G., Berge E. Thrombolytic therapy with recombinant tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke — where do we go from here? A cumulative meta-analysis // Stroke, 2003; 34: 1437-1442.

77. Wiessner C., Sauer D., Alaimo D., Allegrini P.R. Protective effect of a caspase inhibitor in models for cerebral ischemia in vitro and in vivo // Cell. Mol. Biol., 2000; 46: 53-62.

78. Windisch M., Albrecht E., Eggenreich U., Paier B. Neurotrophic effects of the nootropic drug Cerebrolysin — a summary // Adv. Biosci, 1993; 87: 355-356.

79. Windisch M., Gschanes A., Hutter-Paier B. Neurotrophic activities and therapeutic experience with a brain derived peptide preparation // J. Neural. Transm., 1998; 53: 289-298.

80. Wronski R., Tompa P., Hutter-Paier B., Crailsheim K., Friedrich P., Windisch M. Inhibitory effect of a brain derived peptide preparation on the Ca+l-dependent protease, calpain // J. Neural. Transm., 2000; 107: 145-157.

81. Youdim M.B.H., BarAm O., Yogev-Falach M., Weinreb O., Maruyama W., Naoi M., Amit T. Rasagiline: neurodegeneration, neuroprotection, and mito-chondrial permeability transition // J. Neurosci. Res., 2005; 79: 172-179.

82. Zhang J.H., Haddad G.G., Xia Y. d-, but not m- and kappa-, opioid receptor activation protects neocor-tical neurons from glutamate-induced excitotoxic injury // Brain. Res., 2000; 885: 143-153.

83. Zhang Z.G., Zhang L., Yepes M., Jiang Q., Li Q.J., Arniego P., Coleman T.A., Lawrence D.A., Chopp M. Adjuvant treatment with neuroserpin increases the therapeutic window for tissue-type plasminogen activator administration in a rat model of embolic stroke // Circulation, 2002; 106: 740-745.

Similar articles

Authors: Савустьяненко А.В., к.м.н., Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького
International neurological journal 3 (33) 2010
Date: 2010.08.06
Categories: Neurology
Эффекты Церебролизина и их значение
Authors: Савустьяненко А.В., Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького
International neurological journal 2 (56) 2013
Date: 2013.04.19
Categories: Neurology
Sections: Specialist manual
Authors: Plosker G.L., Adis, a Wolters Kluwer Business, Auckland, New Zealand; Gauthier S., McGill Center for Studies in Aging, Montreal, Quebec, Canada
International neurological journal 1 (31) 2010
Date: 2010.08.04
Categories: Neurology
Authors: Новикова Л.Б., Мустафин М.С., Гехтман А.Б., Башкирский государственный медицинский университет, больница скорой медицинской помощи, г. Уфа, Россия
International neurological journal 4 (34) 2010
Date: 2010.08.23
Categories: Neurology

Back to issue