Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.



СІМЕЙНІ ЛІКАРІ ТА ТЕРАПЕВТИ

НЕВРОЛОГИ, НЕЙРОХІРУРГИ, ЛІКАРІ ЗАГАЛЬНОЇ ПРАКТИКИ, СІМЕЙНІ ЛІКАРІ

КАРДІОЛОГИ, СІМЕЙНІ ЛІКАРІ, РЕВМАТОЛОГИ, НЕВРОЛОГИ, ЕНДОКРИНОЛОГИ

СТОМАТОЛОГИ

ІНФЕКЦІОНІСТИ, СІМЕЙНІ ЛІКАРІ, ПЕДІАТРИ, ГАСТРОЕНТЕРОЛОГИ, ГЕПАТОЛОГИ

ТРАВМАТОЛОГИ

ОНКОЛОГИ, (ОНКО-ГЕМАТОЛОГИ, ХІМІОТЕРАПЕВТИ, МАМОЛОГИ, ОНКО-ХІРУРГИ)

ЕНДОКРИНОЛОГИ, СІМЕЙНІ ЛІКАРІ, ПЕДІАТРИ, КАРДІОЛОГИ ТА ІНШІ СПЕЦІАЛІСТИ

ПЕДІАТРИ ТА СІМЕЙНІ ЛІКАРІ

АНЕСТЕЗІОЛОГИ, ХІРУРГИ

"News of medicine and pharmacy" 5(209) 2007

Back to issue

Влияние тиотриазолина на гистоморфологические изменения нейронов коры и гиппокампа в постинсультный период

Authors: И.Ф. БЕЛЕНИЧЕВ, И.А. МАЗУР, Ю.М. КОЛЕСНИК, А.В. АБРАМОВ, Н.В. БУХТИЯРОВА, И.В. СИДОРОВА, Запорожский государственный медицинский университет, НПО «Фарматрон»

Categories: Neurology

Sections: Clinical researches

print version

В последнее время отмечается значительный рост сосудистых заболеваний головного мозга. Ежегодно в мире переносят инсульт около 6 млн человек, из них 4,7 млн умирают. В большинстве стран инсульт занимает 2–3-е место в структуре общей смертности населения, уступая лишь злокачественным новообразованиям и кардиоваскулярной патологии. Таким образом, лечение мозгового инсульта является одной из актуальных задач современной медицины [3].

Наиболее интенсивно поиск препаратов церебропротективного действия ведется среди антагонистов кальциевых каналов L‑типа, блокаторов фенциклидинового и глутаминового сайтов NMDA-рецепторов, позитивных модуляторов AMPA-рецепторов, агонистов ГАМК-рецепторов, веществ, нормализующих биоэнергетические процессы в нейроне, и антиоксидантов [3, 5, 6].

Целью настоящей работы явилась оценка влияния тиотриазолина и пирацетама на изменение морфологических показателей повреждений нейронов коры лобной доли и гиппокампа у крыс с ОНМК по типу ишемического инсульта.

Материалы и методы исследования

Эксперименты выполнены на крысах линии Вистар обоих полов массой 250–270 г, полученных из питомника ИФТ АМН Украины, в осенне-зимний период. Животные содержались в индивидуальных клетках в условиях 14-часового светового цикла при температуре 20–22 °C на стандартном рационе вивария.

Двустороннюю перевязку общих сонных артерий выполняли под этаминал-натриевым наркозом (40 мг/кг) с использованием хирургического доступа путем выделения сонных артерий и одномоментного наложения на них шелковой лигатуры [17].

Животные были разделены на 3 группы: I — животные с инсультом (контрольная группа); II — животные с инсультом, получавшие пирацетам; III — животные с инсультом, получавшие тиотриазолин. В каждой экспериментальной группе было по 10 животных, а в контрольной — 20. Изучаемые препараты вводили внутрибрюшинно через 12 часов после операции один раз в сутки в течение 4 дней: пирацетам (АО «Галычфарм») — 250 мг/кг, тиотриазолин (АО «Галычфарм») — 50 мг/кг.

Животные были забиты спустя 96 часов после окклюзии (на 4-е сутки) под этаминал-натриевым наркозом (40 мг/кг) и перфузированы ледяным фосфатным буфером через восходящую аорту в течение 5 мин. Мозг быстро извлекали и помещали на сутки в фиксатор Карнуа [16]. После стандартной гистологической проводки ткань заключали в парафин [16].

Для изучения морфологии нейронов на ротационном микротоме изготавливали 4‑микронные срезы пирамидного слоя нейронов сенсомоторной зоны фронтальной коры и гиппокампа, которые депарафинировали и окрашивали для определения содержания нуклеиновых кислот галлоцианин-хромовыми квасцами по Эйнарсону [5]. Морфометрические исследования проводили на микроскопе Axioskop («Zeiss», Германия). Изображения нейронов в области зоны CA1 гиппокампа (структура, отвечающая за механизмы памяти, наиболее чувствительная к ишемии зона коры головного мозга) и пирамидного слоя в лобной коре (ассоциативные нейроны), получаемые на микроскопе, с помощью высокочувствительной видеокамеры COHU-4922 («COHU Inc.», США) вводили в компьютерную программно-аппаратную систему цифрового анализа изображения DIAS, разработанную в ЗГМУ под руководством проф. Ю.М. Колесника [16]. Анализ изображений проводили в полуавтоматическом режиме. Дегенерирующими считались нейроны, имеющие признаки кариопикноза, кариорексиса или цитолиза. При анализе в качестве выживших подсчитывались лишь те нейроны, которые в площади среза содержали ядрышко. Программно измерялись плотность расположения выживших и дегенерирующих нейронов, соотношение числа интактных нейронов к гибнущим (индекс нейродегенерации) и отношение плотности выживших нейронов при использовании препарата к плотности интактных нейронов в контрольной группе (индекс улучшения выживаемости). Так как часть погибших нейронов к моменту гистологического исследования уже была фагоцитирована клетками микроглии, отдельно оценивался индекс относительной активности микроглии, равный частному от деления разности в плотности выживших нейронов на разность в плотности дегенерирующих нейронов (разность между группой контроля и соответствующего фармакологического препарата). Величина индекса нейродегенерации менее единицы свидетельствовала о преобладании числа гибнущих нейронов над выжившими; индексы улучшения выживаемости и активности микроглии более единицы свидетельствовали о позитивном действии фармакологического препарата, менее единицы — о негативном. О функциональном состоянии выживших нейронов судили на основании изменения площади ядер и ядрышек нейронов, содержания в них нуклеиновых кислот, ядерно-цитоплазматического соотношения и количества многоядрышковых клеток.

Полученные данные имели нормальное распределение. Отличия между группами оценивали статистически с использованием t-критерия Стьюдента. Достоверность отличий относительных величин оценивалась с применением критерия χ2. Достоверными считали отличия с уровнем значимости более 95 % (p < 0,05).

Результаты и обсуждение

У животных контрольной группы, перенесших ишемический инсульт в результате двусторонней необратимой окклюзии общих сонных артерий, на четвертые сутки наблюдалось четырехкратное преобладание количества дегенерирующих пирамидных нейронов над выжившими в сенсомоторной зоне фронтальной коры и практически двукратное — в СА1 зоне гиппокампа (табл. 1). При этом в сенсомоторной зоне фронтальной коры гибель нейронов с одинаковой вероятностью происходила как с проявлением морфологических признаков кариопикноза, кариорексиса и цитопикноза, так и с проявлениями цитолиза (рис. 1А). С другой стороны, в гиппокампе в два раза чаще наблюдался цитолитический тип гибели нервных клеток (табл. 1). Мы предполагаем, что морфологические признаки цитолиза свидетельствуют о глубоком повреждении мембранного аппарата клеток — в первую очередь из-за избыточной продукции свободнорадикальных соединений на фоне глубокого энергетического дефицита.

Использование пирацетама приводило к значительному усилению процессов нейродегенерации в сенсомоторной зоне лобной коры: в пирамидном слое визуализировались лишь единичные выжившие нейроны; большая часть клеток была представлена пикнотическими клетками (рис. 1В). При этом величина индекса выживаемости была снижена в 25 раз, а индекса относительной активности микроглии — в 3 раза (табл. 1). Еще более сильное ишемическое повреждение в этой группе животных испытывала ткань гиппокампа: у всех крыс гиппокамп на всем своем протяжении был полностью разрушен — на его месте наблюдалась киста (рис. 1Г). Таким образом, пирацетам в острый период мозгового инсульта обладает негативным действием, так как, влияя на исключительно анаэробное окисление, способен усиливать явления лактат-ацидоза и тем самым ухудшать общую картину ишемии мозга, что в целом подтверждается результатами биохимических экспериментальных и клинических исследований [7, 9, 12, 18].

Тиотриазолин обладал значительным нейропротекторным действием (табл. 1). Так, тиотриазолин в 2 раза ослаблял процессы нейрональной гибели в сенсомоторной зоне фронтальной коры; и в 1,8 раза — для пирамидных нейронов СА1 зоны гиппокампа (табл. 1).

Причиной этого могло служить то, что механизм церебропротективного действия тиотриазолина в значительной степени обусловлен его антиоксидантным действием и связан со способностью оказывать активирующее действие на систему антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутаза и глутатионпероксидаза), способностью ингибировать АФК, а также его мембраностабилизирующим действием [9, 11, 13–15].

Тиотриазолин как в лобной коре, так и в гиппокампе практически оказывал влияние на элиминацию погибших нейронов, о чем свидетельствует величина индекса относительной активности микроглии (табл. 1), а пирацетам напротив, приводил к трехкратному снижению относительной функциональной активности микроглиальных фагоцитов в сенсомоторной зоне фронтальной коры.

Подтверждением значительных антиоксидантных свойств тиотриазолина служило снижение относительного количества случаев цитолиза нейронов в лобной коре, и особенно в гиппокампе (табл. 1).

При анализе морфологических показателей функциональной активности (табл. 2), которые позволяют давать оценку интенсивности процессов активации генов и синтеза белка [9, 12, 15, 18], было установлено, что применение тиотриазолина вызывало снижение доли функционально неактивного гетерохроматина в основном в ядрах нейронов гиппокампа. Это свидетельствовало о значительной стимуляции генной активности и об активации процессов трансляции. Подобным образом в ядрышках (местах продукции рибосомальной РНК) и цитоплазме нейронов при использовании тиотриазолина достоверно возрастала концентрация нуклеиновых кислот в гиппокампе, что свидетельствовало об усилении процессов синтеза белка вследствие активации трансляции мРНК на рибосомах (табл. 2).

Эти данные согласуются с нашими предыдущими работами, в которых показано, что тиотриазолин в острый период ишемического инсульта у животных с экспериментальной моделью ишемии приводит к нормализации многих показателей углеводно-энергетического обмена, гиперферментемии (ВВ-КФК) [1, 2, 4, 6–10], уменьшает степень выраженности ишемического повреждения головного мозга за счет позитивного влияния на аэробные пути выработки энергии. Кроме того, назначение тиотриазолина приводило к уменьшению активности реакций СРО, гиперпродукции NO и продуктов окислительной модификации белка, сопровождалось активацией АО-системы головного мозга [3, 6, 7, 9].

Тиотриазолин ослабляет развитие неврологического дефицита, ускоряет восстановление неврологического статуса, улучшает процессы обучения и памяти и снижает показатели гибели животных [1, 6, 7].

Выводы

1. Тиотриазолин обладает выраженным нейропротекторным действием в период острого мозгового инсульта. При этом тиотриазолин наиболее эффективен в отношении торможения нейрональной гибели в сенсомоторной зоне фронтальной коры, и особенно в зоне СА1 гиппокампа.

2. Ишемическая гибель нейронов в сенсомоторной зоне фронтальной коры с равной вероятностью происходит путем кариопикноза или цитолиза, в то время как в гиппокампе — преимущественно путем цитолиза. Тиотриазолин является мощным мембранопротектором, о чем свидетельствует значительное снижение частоты цитолиза в коре, и особенно в гиппокампе.

3. Использование пирацетама в острый период мозгового инсульта приводит к многократному усилению нейрональной гибели в различных зонах коры головного мозга вплоть до полного разрушения нервной ткани с образованием кист (в гиппокампе).

4. Тиотриазолин реализует свое нейропротекторное действие в гиппокампе на фоне увеличенной активности трансляционных и транскрипционных процессов, а в сенсомоторной зоне фронтальной коры вызывает нейропротекцию на фоне невыраженной транскрипционной и трансляционной активности.

Перспективным в направлении дальнейшего изучения терапевтического потенциала антиоксиданта тиотриазолина является выявление специфических генов, изменяющих свою активность под действием данного лекарственного средства и ответственных за наблюдаемое нейропротекторное действие.


Bibliography

1. Бєленічев І.Ф. Порівняльна оцінка антиоксидантної і протиішемічної активності тіотриазоліну і пірацетаму за умов експериментальної ішемії головного мозку // Одеський мед. журн. — 1999. — 4(54). — С. 28-31.

2. Беленичев И.Ф., Мазур И.А., Коваленко С.И. Некоторые аспекты противоишемического действия тиотриазолина в условиях экспериментального нарушения мозгового кровообращения // Акт. питання фармац. та мед. науки. — Запоріжжя, 2002. — Вип. VIII. — С. 43-48.

3. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. — М.: Медицина, 2001. — 328 с.

4. Коваленко С.И., Беленичев И.Ф., Бухтиярова Н.В. Производные хиназолина — перспективные нейропротективные средства с антиоксидантным механизмом действия // Запор. мед. журн. — 2004. — Т. 2, № 1(22). — С. 1-7.

5. Пирс Э. Гистохимия. — Москва, 1962. — 962 с.

6. Дунаев В.В., Коваленко С.И. Коррекция экспериментальных нарушений когнитивных функций антиоксидантами // Biomedical and biosocial anthropology. — 2004. — № 3. — С. 113-115.

7. Беленичев И.Ф., Мазур И.А., Чекман И.С. Молекулярный механизм энерготропного и антиоксидантного действия тиотриазолина // Ліки. — 2006. — № 3, 4. — С. 12-16.

8. Тиотриазолин / И.А. Мазур, Н.А. Волошин, И.С. Чекман и др. — Запорожье, 2005. — 156 с.

9. Церебропротективные эффекты антиоксидантов при нейродеструктивных нарушениях, обусловленных токсическим действием кислородных радикалов / В.В. Дунаев, Ю.И. Губский, И.Ф. Беленичев и др. // Современные проблемы токсикологии. — 2004. — № 1. — С. 7-14.

10. Церебропротективні ефекти похідних 4‑гідразинохіназоліну в умовах двосторонньої перев'язки загальних сонних артерій (ішемічний інсульт) / Сидорова І.В., Бєленічев І.Ф., Коваленко С.І., Бухтіярова Н.В., Нестерова Н.О. // Ліки. — 2004. — № 5-6. — С. 45-51.

11. Floyd R.A. Free radicals damage to protein and DNA: Mechanisms involved and relevant observations on brain undergoing oxidative stress // Ann. Neurol. — 2002. — Vol. 32, № 2. — P. 22-37.

12. Ginsberg M.D. Adventures in pathophysiology of brain ischemia: penumbra, gene expression, neuroprotection. The Thomas Willis lecture // Stroke. — 2003. — Vol. 34, № 1. — P. 214-223.

13. Halliwell B., Auroma O. Molecular Biology of Free Radicals in Human Diseases. — St. Lucia London: OICA Int, 1999. — 352 p.

14. Halliwell B. Free Radicals Biology Medicine. — Oxford Press, 1999. — 248 p.

15. Lipton P. Ischemic cell death in brain neurons // Physiological Reviews. — 1999. — Vol. 79, № 4. — P. 1431-1568.

16. Kolesnik Y.M., Orlovsky M.A. Image analysis system for quantitative immunofluorescence measurement // Microscopy and Analysis. — 2002. — № 5. — P.12-16.

17. McGrow C.P. Experimental Cerebral Infarction Effects of Pentobarbital in Mongolian Gerbils // Arch. Neurol. — 1977. — Vol. 34, № 6. — Р .334-336.

18. Wada K., Sugimori H., Bhide P.D., Moskowitz M.A., Finkelstein S.P. Effect of basic fibroblast growth factor treatment on brain progenitor cells after permanent focal ischemia in rats // Stroke. — 2003. — Vol. 34, № 11. — P. 2722-2728.


Back to issue