Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.

"Medical and social problems of family" 1 (том 17) 2012

Back to issue

Генетический профиль семей с нарушением репродуктивной функции

Authors: В.В. Грабарь, Центр репродукции человека «CАНА-МЕД», г. Харьков

Categories: Obstetrics and gynecology

Sections: Clinical researches

print version


Summary

Цель. Изучение генетических особенностей супружеских пар с бесплодием в про-граммах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).
Материалы и методы. Проведено медико-генетическое консультирование (МГК), исследование кариотипа, ядер сперматозоидов на наличие анеуплоидий методом fluorescence in situ hybridization (FISH), генов сystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), аzoospermia factor (AZF)-локуса, fragile X mental retardation 1 (FMR1), androgen receptor (AR) у 122 супружеских пар с женским и 64 с мужским бесплодием.
Результаты. Хромосомные нарушения выявлены у 9,8% супружеских пар с женским и у 12,5% с мужским бесплодием, среди пациентов с мужским фактором врожденные пороки разви-тия и генетические нарушения встречались в 2 раза чаще. У пар с нерезультативными программа-ми экстракорпорального оплодотворения выявлено достоверное увеличение частоты «функцио-нально неблагоприятных» генотипов II фазы системы детоксикации и фолатного обмена.
Выводы. Супружеским парам в программах ВРТ необходимо проводить МГК и гене-тическое обследование для выявления хромосомной и моногенной патологии членов

Мета. Вивчення генетичних особливостей подружніх пар з безпліддям в програмах допоміжних репродуктивних технологій (ДРТ).
Матеріали та методи. Проведено МГК, дослідження каріотипу, ядер сперматозоїдів на наявність анеуплоїдій методом FISH, генів CFTR, AZF-локусу, FMR1, AR у 122 подружніх пар з жіночим і 64 з чоловічим безпліддям.
Результати. Хромосомні порушення виявлені у 9,8% подружніх пар з жіночим і у 12,5% з чоловічим безпліддям, серед пацієнтів з чоловічим чинником вроджені вади розвитку та генетичні порушення зустрічалися в 2 рази частіше. У пар з нерезультативними програмами екстракорпорального запліднення виявлено достовірне збільшення частоти «функціонально несприятливих» генотипів II фази системи детоксикації та фолатного обміну.
Висновки: Подружнім парам в програмах ДРТ необхідно проведення МГК і генетичного обстеження для виявлення хромосомної та моногенної патології лікування

Objective. Study of genetic characteristics of couples with infertility in assisted reproductive technology (ART) programs.
Materials and methods. A medico-genetic counseling, a study of karyotype, FISH of sperm nuclei, CFTR, AZF-locus, FMR1, AR genes in 122 couples with a female and 64 with male infertility were done.
Results. Chromosomal abnormalities were detected in 9.8% of couples with a female and 12.5% with male infertility, in patients with male factor congenital malformations and genetic disorders occurred in 2 times more often. In couples with ineffective in vitro fertilization program a significant increase in frequency of "functionally unfavorable" genotypes of phase II detoxification system and folate metabolism were revealed.
Conclusions. Couples in ART programs should be carried out of the medico-genetic counseling and genetic testing to detect chromosomal and monogenic diseases


Keywords

бесплодие, ВРТ, хромосомная патология, полиморфизм генов

безпліддя, ДРТ, хромосомна патологія, поліморфизм генів

infertility, ART, chromosomal pathology, polymorphism of genes

Всемирная организация здравоохранения назвала бесплодие одной из наиболее важных проблем здоровья современного человечества, так как в современном мире нарушениями репродуктивной функции страдает каждая шестая супружеская пара [1, 3, 7]. Количество бесплодных пар постоянно растет не только из-за позднего репродуктивного возраста женщин, но и в связи с ухудшением качества гамет вследствие неблагоприятных средовых факторов и особенностей современного стиля жизни [2, 3, 10].

Со времени рождения первого ребенка с помощью in vitro fertilization (IVF) в 1978г., во всем мире с помощью ВРТ появилось почти 2 млн. детей [8, 12]. Контингент пациентов программ ВРТ достаточно широкий, и в настоящее время он не ограничивается бесплодными парами. Наряду с ними к ВРТ прибегают одинокие женщины, ВИЧ-дискордантные пары, родители, пытающиеся с помощью предгестационной диагностики в программах ВРТ выбрать HLA-соответствующего эмбриона и решить проблему лечения больного сибса путем использования стволовых клеток пуповинной крови [10].

Широкое распространение методов ВРТ делает актуальными вопросы изучения генетического риска для детей, рожденных с помощью этих методов. В современной литературе имеются данные о повышенном материнском и перинатальном риске при ВРТ-беременности, и если ранее это связывалось только с многоплодием, то в последствии было показано, что и одноплодная ВРТ-беременность ассоциирована с повышенным риском вагинальных кровотечений, предлежания плаценты, преэклампсии, недоношенности, СЗРП, причины которых до конца не выяснены [11]. Что касается увеличения частоты врожденных пороков развития (ВПР) у детей, рожденных с помощью ВРТ, то здесь данные неоднозначные – от отсутствия существенного риска, до его 25-40 % возрастания [8, 12].

Возможных причин, вызывающих повышение риска ВПР и перинатальных осложнений у ВРТ-детей может быть несколько, и, если исключить многоплодие, то они могут быть отнесены к самой процедуре применения ВРТ (микроманипуляции с гаметами), воздействию на гаметы препаратов для стимуляции овуляции, состоянию здоровья бесплодных родителей.

Целью нашей работы явилось изучение генетических особенностей супружеских пар с бесплодием в программах ВРТ.

Материалы и методы 

На первом этапе нами были обследованы 186 супружеских пар с бесплодием, включенные в программы ВРТ в 2007-2010 гг. Все пациенты были разделены на две группы.

Группу 1 составили 122 супружеские пары с женским бесплодием различной этиологии: трубно-перитонеального генеза – у 37 (30,3%); эндокринного – у 49 (40,2%), эндометриоз – у 30 (24,5%); маточный фактор – у 6 (5%). Этим пациентам проводились программы IVF.

Группу 2 составили 64 супружеские пары с мужским фактором бесплодия, этим парам проводились IVF + intracytoplasmic sperm injection (ICSI). В группе 1 возраст женщин был 26-45 лет, мужчин – 32-55 лет; в группе 2 соответственно 24-43 и 30-62 года.

В нашей работе мы применяли медико-генетическое консультирование (МГК) всех супружеских пар с применением генеалогического анализа. Дополнительно к стандартному обследованию для программы IVF были произведены: исследование кариотипа, ядер сперматозоидов методом FISH, генов CFTR, AZF-локуса, FMR1, AR. Цитогенетическое исследование было проведено на препаратах метафазных хромосом, которые получали из лимфоцитов периферической крови, культивируемых в условиях in vitro, в соответствии со стандартной методикой [9], хромосомы идентифицировали после дифференцированного окрашивания (С-метод).

Для молекулярно-цитогенетических исследований препараты клеток эякулята готовили по методу, предложенному в 1994 г. Н. Guttcnbach [9], гибридизацию in situ проводили в соответствии с протоколом, рекомендуемым фирмой-производителем. Молекулярно-генетические исследования проводились методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) согласно рекомендациям фирм-производителей.

На втором этапе нами сформирована группа А из 35 супружеских пар (из пациентов групп 1 и 2 на I-м этапе), которые имели 2 и более неэффективные программы ЭКО, для выявления наследственных предпосылок нарушения имплантации. Возраст женщин и мужчин в этой группе составил соответственно 28±0,5 лет и 35±0,2 лет. В эту группу мы отбирали пациентов без очевидных предпосылок неэффективных программ ВРТ – с нормальным кариотипом, отсутствием носительства гена CFTR, микроделеций локуса AZF у мужчин, женщин с достаточным овариальным резервом (по данным ультразвукового исследования, исследования фолликулостимулирующего гормона, ингибина, антимюллерового гормона), без внутриматочной патологии (аномалии развития матки, фибромиома матки, аденомиоз).

Контрольную группу В составили 11 супружеских пар, у которых программа ЭКО была успешной в течение 1-2 циклов. По возрастным характеристикам, анамнестическим данным, состоянию соматического и репродуктивного здоровья эти группы были сопоставимы.

У этих пациентов нами дополнительно проводилось исследование полиморфизма генов системы фолатного обмена (MTHFR, MTRR), генов I фазы системы детоксикации цитохрома P 450 (CYP1A1), генов II фазы системы детоксикации глутатионтрансферазы (GSTP, GSTM1, GSTT1).

Статистическую обработку результатов проводили по t-критерию в компьютерной программе STATISTICA, а также по χ2 в компьютерной программе STATGRAF. Достоверными считали различия при значениях с вероятностью р≤0,5.

Результаты и их обсуждение

Изучение семейного анамнеза супружеских пар, находящихся под наблюдением, позволило обнаружить у 55 (45,1%) пациентов (женщин и мужчин) нарушения в репродуктивном анамнезе у родственников I и II степени родства.

В 1 группе 30 (24,6%) пар имели подобные проблемы: у 10 (8,2%) женщин и у 7 (5,7%) мужчин у родственников отмечено бесплодие, у 7 (5,7%) и 5 (4,1%) – невынашивание беременности, у 1 пациентки у двоюродной сестры – синдром Шерешевского-Тернера (45 Х0).

В группе 2 у 19 (29,7%) супружеских пар у родственников I и II степени родства выявлен осложненный репродуктивный анамнез: бесплодие в семьях у 2 (3,1%) женщин и у 7 (10,9 %) мужчин, невынашивание беременности соответственно у 3 (4,7%) и 5 (7,8%), у 1 пациента родной брат имел полисомию по хромосоме Y (47XYY), у 1 – двоюродный брат страдал муковисцидозом.

При МГК и обследовании на носительство мутаций некоторых генов, в том числе «динамических» мутаций в группе 1 у 2 женщин выявлен синдром Рокитанского-Кюстнера-Хайшера, у 2 – врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН), обусловленная недостаточностью 21-гидроксилазы (мягкая форма), у 2 – ≥ 40 СGG-повторов в гене FMR1. В группе 2 у 1 пациентки была мягкая форма ВДКН, обусловленная недостаточностью 21-гидроксилазы.

Во 2-й группе у 2 мужчин выявлен синдром Юнга, у 1 – неполный синдром Картагенера, у 1 – поликистоз почек у 2 – микроделеции AZF-локуса Y-хромосомы, у 2 – мутации гена муковисицидоза СFTR, у 2 – ≥ 30 САG-повторов в гене AR.

Генетические нарушения в 2 раза чаще встречались в группе 2. Отягощенность генетического статуса у бесплодных супругов указывает на важность МГК до начала программ ВРТ. При выявлении генетической патологии пациенты должны быть осведомлены о риске передачи потомству этих нарушений, так как решение о лечении методами ВРТ принимает супружеская пара.

Так, например, наличие динамических мутаций в гене AR-рецептора при количестве САG-тринуклеотидных повторов более 30 вызывает нечувствительность тканей к андрогенам с развитием азооспермии, а экспансия САG-тринуклеотидных повторов более 50 в последующих поколениях может приводить к рождению мальчиков со спинобульбарной мышечной атрофией. Возрастание количества СGG-повторов в гене FMR1 более 44 сопряжено с преждевременным истощением яичников, а их экспансия до 200 приводит к развитию синдрома Мартина-Бела, наиболее распространенной после синдрома Дауна формы умственной отсталости [5].

Уровень хромосомных изменений у пациентов 2-й группы был выше (12,5% по сравнению с 9,8% в 1 группе,р<0,05) за счет хромосомной патологии у мужчин с азооспермией. Наши данные о высоком уровне хромосомных аберраций у пациентов с бесплодием по сравнению с общепопуляционными подтверждаются результатами исследований других авторов [3].

При анализе данных кариотипа, в группе 1 у женщин обнаружено преобладание хромосомных изменений в комплексе половых хромосом в виде мозаицизма (46ХХ/45Х0 – у 3 (2,5%), 46ХХ/47ХХХ – у 3 (2,5%), 46ХХ/47ХХХ/45Х0 – у 2 (1,6%)). Хромосомные перестройки аутосом были представлены в 1 наблюдении перицентрической инверсией (46ХХ, inv(2)(p12q14)).

У мужчин группы 1 в 1 случае выявлена перицентрическая инверсия (46XY, inv(2)(p12q14)).

Исследование кариотипа у супружеских пар в группе 2 позволило выявить нормальный кариотип у 87,5%, хромосомную патологию – у 12,5% (во всех случаях у мужчин).

Результаты исследования показали, что среди хромосомных изменений у мужчин группы 2 обнаруживались перестройки аутосом, представленные транслокациями и перицентрическими инверсиями (у 1 – 46XY, inv(3)(p21q12); у 1- 46XY, t(13/14)(q10q10); у 1 – 46XY, t(7/16)(q21q22); у 1 – 46XY, inv(7)(p11q11)), также выявлены кариотипы, соответствующие синдрому полисомии хромосомы Y (у 1 – полная форма 47 XYY и у 1 – мозаичная 47XXY/46XY), мозаичной форме синдрома Клайнфельтера (у 1 – 47XXY/46XY), мозаицизм с присутствием клона клеток с женским кариотипом (у 1 – 46XY/46 ХХ).

FISH исследование сперматозоидов произведено 85 пациентам групп 1 и 2. Всего из группы 1 было обследовано 27 мужчин. Средняя частота анеуплоидий в сперматозоидах по хромосомам Х и Y у мужчин с нормальным кариотипом составила 0,25%, что сравнимо со значением в популяции фертильных мужчин, с нормальными показателями спермограммы (<0,6%) [3, 8]. У пациента с инверсией хромосомы в кариотипе – 0,9% анеуплоидий по хромосомам Х и Y.

Из группы 2 было обследовано 58 мужчин. Средняя частота анеуплоидий в сперматозоидах по хромосомам Х и Y у мужчин с нормальным кариотипом составила 0,49%. У пациента с мозаичной формой полисомии хромосомы Y в кариотипе доля анеуплодии по хромосомам Х и Y в сперматозоидах была 0,8%, при инверсиях 3-й и 7-й хромосом в кариотипе – 1,2%; при робертсоновской транслокации 13/14 – 1,6%, при транслокации 7/16 – 1,4%.

У пациентов с нормальным кариотипом в обеих группах соотношение сперматозоидов с хромосомой Х к сперматозоидам с хромосомой Y было 1:1. Выявленная в сперматозоидах хромосомная патология была представлена нерасхождением хромосом ХY, ХХ, YY.

Таким образом, хромосомные аберрации могут явиться одной из причин, приводящей к бесплодию, и, как следствие, у этих пациентов могут формироваться гаметы с хромосомными аберрациями. Исследования сперматозоидов пациентов с аномалиями в кариотипе методом FISH позволили выявить высокую частоту анеуплодий гоносом, что подтверждает существование интерхромосомного эффекта, когда независимо от того, какие хромосомы вовлечены в хромосомные аберрации, в кариотипе в процессе мейоза могут происходить нарушения расхождения любых других хромосом [2, 3]. Таким образом, у пациентов с изменениями в кариотипе могут формироваться гаметы с мутациями de novo, использование которых в программах ВРТ может привести к рождению ребенка с генетической патологией.

На втором этапе проведено исследование полиморфизма генов I фазы системы детоксикации, которое не выявило достоверных различий в частоте аллельных вариантов в группах пациентов с эффективными и неэффективными программами ЭКО (группы А и В) (Р>0,05).

Исследование полиморфизма генов II фазы системы детоксикации выявило в группе А повышение частоты «функционально ослабленного» генотипа по гену GSTM1 у 51, 4% женщин, по гену GSTT1 у 28,6%, по гену GSTP1 у 17,1% по сравнению с группой контроля соответственно 36,4%, 18,2 %, 9,1% (Р<0,05). У 10 (28,6%) женщин выявлено увеличение частоты сочетанных «неблагоприятных» генотипов по 2 генам системы детоксикации GSTM1 и GSTT1 или GSTM1 и GSTP1, у 4 (11,4 %) – по трем генам GSTM1, GSTT1,GSTP1. Таких сочетанных «неблагоприятных» генотипов в группе контроля не было (Р<0,05).

У мужчин группы А также достоверно чаще определялись сочетанные «функционально неблагоприятные» генотипы по трем генам GSTM1, GSTT1, GSTP1, Р<0,05).

Таким образом, проведенное обследование пар с неэффективными программами ЭКО показало повышение частоты «функционально ослабленного» генотипа по генам GSTM1, GSTT1, GSTP1 (генов II фазы системы детоксикации) как у женщин, так и мужчин. Как известно, гены этой системы участвуют во второй фазе детоксикации и катализируют процессы метаболизма различных ксенобиотиков и канцерогенов, поступающих в организм; они играют важную роль в антенатальном развитии и активно влияют на устойчивость зародыша к неблагоприятным экзогенным факторам [6].

При анализе полиморфизма генов фолатного цикла MTHFR и MTRR также выявлены статистически значимые результаты. У женщин группы А отмечено значительное увеличение частоты «функционально ослабленного» генотипа MTHFR Т/Т по сравнению с пациентками группы контроля (34,3% и 18,2%, Р<0,05). При этом у мужчин группы А также достоверно увеличена частота генотипа MTHFR Т/Т (45,7%) по сравнению с мужчинами контрольной группы (18,2%, Р<0,05).

При изучении полиморфизма второго гена фолатного цикла MTRR зарегистрировано повышение частоты «функционально ослабленного» генотипа MTRR G/G у женщин и мужчин группы А по сравнению с группой контроля (Р<0,05). Кроме того, у 5 (14,3%) женщин группы А отмечено сочетание «функционально неблагоприятных» генотипов: MTHFR Т/Т и MTRR G/G; у 3 (8,6%) мужчин из пар группы А – MTHFR Т/- и MTRR G/G.

Таким образом, у пар с неэффективными программами ЭКО в нашем исследовании достоверно чаще встречались низкофункциональные аллели генов фолатного обмена. В литературе есть данные, что наличие низкофункциональных аллелей генов фолатного обмена вследствие изменения профиля метилирования ДНК в клетке может приводить к нарушению расхождения хромосом в процессе формирования гамет и возникновению анеуплоидии у плода. Данные механизмы описаны для трисомий 21, 18 [6]. Дефицит метильных групп в быстро делящихся клетках эмбриона приводит к повышенному включению уридилового нуклеотида вместо тимидилового в синтезируемую цепь ДНК. В результате образуется аномально легко фрагментируемая ДНК, синтез ее резко замедляется, что ведет к нарушению клеточного цикла быстро делящихся клеток плода, и, возможно, способствует запусканию механизмов апоптоза [4].

При нарушении фолатного обмена, кроме вышеперечисленных механизмов нарушения эмбриогенеза, происходят нарушения некоторых звеньев имплантации. У людей с «функционально ослабленными» генотипами по генам MTHFR и MTRR формируется гипергомоцистинемия, что приводит к эндотелиальной дисфункции, сопровождающейся развитием атеросклероза сосудов, десинхронизацией процессов фибринолиза и фибринообразования, вазоконстрикцией, что, вероятно, способствует нарушению нидации плодного яйца, инвазии трофобласта [4, 6].

Выводы

Супружеским парам, участвующим в программах ВРТ необходимо проводить МГК и генетическое обследование для выявления хромосомной и моногенной патологии.

В программу обследования супружеских пар, имеющих в анамнезе неудачные попытки ЭКО, необходимо включать молекулярно-генетическое обследования для выявления низкофункциональных аллелей генов фолатного обмена и генов II системы детоксикации.

Заключение

Дальнейшие исследования генотипа бесплодных супружеских пар позволит формировать оптимальную тактику ведения этих пациентов. При выявлении хромосомной и моногенной патологии у родителей целесообразно применять предимплантационную диагностику для профилактики рождения больного потомства.


Bibliography

  1. Акопян А.С. Биосоциальные аспекты репродукции человека и приоритеты демографической политики / А.С. Акопян // Проблемы репродукции. – 2008. – №3. – С.18–23.
  2. Баранов В.С. Цитогенетика эмбрионального развития человека / В.С. Баранов, Т.В. Кузнецова – СПб, 2007. – 640с.
  3. Глинкина Ж. И. Цитогенетическое обследование супружеских пар, включенных в программы вспомогательных репродуктивных технологий / Ж.И. Глинкина, Л.Н. Кузьмичев, В.В. Мамонова //Акушерство и гинекология. – 2010. – № 3. – С. 39-42.
  4. Джанджгава Ж. Г. Неудачи ЭКО и материнская тромбофилия / Ж.Г. Джанджгава // Проблемы репродукции. – 2005. – №5 – С. 41–43.
  5. Лившиц А.Б. Генетические аспекты преждевременного истощения яичников / А.Б. Лившиц, Л.А. Лившиц, С.А. Кравченко // Медицинские аспекты здоровья женщины. – 2006. – №1. – С. 24-28.
  6. Фетисова И.Н. Полиморфизм генов фолатного обмена и болезни человека / И.Н. Фетисова, А.С. Добролюбов, М.А. Липин [та ін.] // Вестник новых медицинских технологий. – 2007. – № 1. – С.189-195.
  7. Claustres M. Molecular pathology of CFTR locus in male infertility / М. Claustres // Reproductive BioMedicine Online. – 2005. – Vol.10, N 5. – Р.14-41.
  8. Cohen J. Infertile couples, assisted reproduction and increased risks to the children / J. Cohen // Reproductive BioMedicine Online. – 2007.– Vol.15, N 2. – Р.245-246.
  9. Czepulkowski B. Analyzing chromosomes / B. Czepulkowski. – London: Bios Scientific Publishers Limited, 2001. – 205 p.
  10. El-Chaar D. Risk of birth defects increased in pregnancies conceived by assisted human reproduction / D. El-Chaar, Q. Yang, J. Gao [et. al.] // Fertility and sterility. – 2008. – Vol. 92, N 5. – P. 1557–1561.

Similar articles

Authors: Маджидова Ё.Н., Халимова Х.М., Раимова М.М., Матмурадов Р.Ж., Фахаргалиева С.Р., Жмырко Е.В., Кафедра нервных болезней Ташкентской медицинской академии, Институт генетики и экспериментальной биологии растений АН РУз, г. Ташкент, Узбекистан
International neurological journal 1 (39) 2011
Date: 2011.03.09
Categories: Neurology
Мужское бесплодие. Генетические аспекты
Authors: Тавокина Л.В. - Молекулярно-цитогенетическая лаборатория Медицинского центра ООО «Исида-IVF», г. Киев
"Kidneys" 2 (08) 2014
Date: 2014.06.02
Categories: Nephrology, Urology
Sections: Specialist manual
Authors: Витязева И.И., ФГУ «Эндокринологический научный центр», г. Москва, Россия
International journal of endocrinology 7 (31) 2010
Date: 2010.12.20
Categories: Endocrinology
Value of Gene Polymorphism in the Development of Allergic Disease in Children
Authors: Шумна Т.Є., Соловйова С.В., Зінченко Т.П., Мазур В.І. - Запорiзький державний медичний унiверситет, м. Запоріжжя, Україна
"Child`s Health" 3 (71) 2016
Date: 2016.07.12
Categories: Pediatrics/Neonatology
Sections: Clinical researches

Back to issue