Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.


Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.

International neurological journal 4 (66) 2014

Back to issue

Оценка степени повреждения мозговой ткани методом иммунохимического анализа в острейшем периоде ишемического инсульта

Authors: Черний В.И., Городник Г.А., Куглер С.Е. - Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького, кафедра анестезиологии, ИТ, МНС и кардиохирургии УНИПО

Categories: Anesthesiology and intensive therapy, Neurology

Sections: Clinical researches

print version


Summary

В статье представлены данные клинического, неврологического и иммунологического обследования 116 пациентов в возрасте от 36 до 69 лет в острейшем периоде ишемического инсульта. Пациенты были рандомизированы методом случайных чисел на группу, получавшую терапию по приказу МЗ Украины (№ 487, № 602), и группу, в дополнение к стандартному лечению получавшую нейропротективный комплекс. Целью исследования являлось определение уровней нейронспецифических белков как маркеров повреждения нейронов и глии, а также гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Впервые был создан комплекс мозгового антигена с целью определения титра антител к белому и серому веществу головного мозга. При помощи методов иммунохимического анализа доказано, что включение нейропротективного комплекса в терапию острейшего периода ишемического инсульта значительно улучшает функциональное состояние нейронального и глиального комплекса, препятствует разрушению ГЭБ.

У статті наведені дані клінічного, неврологічного й імунологічного обстеження 116 пацієнтів віком від 36 до 69 років у найгострішому періоді ішемічного інсульту. Пацієнти були рандомізовані методом випадкових чисел на групу, що отримувала терапію за наказом МОЗ України (№ 487, № 602), й на групу, що на додаток до стандартного лікування одержувала нейропротективний комплекс. Метою дослідження було визначення рівнів нейронспецифічних білків як маркерів пошкодження нейронів і глії, а також гематоенцефалічного бар’єру (ГЕБ). За допомогою методів імунохімічного аналізу доведено, що включення нейропротективного комплексу в терапію гострого періоду ішемічного інсульту значно поліпшує функціональний стан нейронального й гліального комплексу, перешкоджає руйнуванню ГЕБ.

The article presents the results of clinical, neurological and immunological examination of 116 patients aged 36 to 69 years in peracute ischemic stroke. Patients were randomized by random numbers to group received treatment according to orders of Ministry of Healthcare of Ukraine (№ 487, № 602), and to group which in addition to standard treatment received neuroprotective complex. Aim of this study was to determine the levels of neuron-specific proteins as markers of neuronal and glial damage, as well as the blood-brain barrier (BBB). For the first time there was created a brain antigen complex to determine the titer of antibodies to the white and gray matter of the brain. Using the methods of immunochemical assay it is proved that the inclusion of neuroprotective complex into the therapy of peracute ischemic stroke significantly improves the functional state of the neuronal and glial complex, prevents destruction of the BBB.


Keywords

ишемический инсульт, нейропротекция, иммунохимический анализ.

ішемічний інсульт, нейропротекція, імунохімічний аналіз.

ischemic stroke, neuroprotection, immunochemical assay.

Статья опубликована на с. 53-58

Введение

Проблема ишемического инсульта получает все большее распространение и оказывает серьезное влияние на систему здравоохранения, с каждым годом увеличивая затраты на лечение. Ишемический инсульт является, по сути, серьезной социальной проблемой как в развитых, так и в развивающихся странах.

Говоря о современных международных протоколах лечения ишемического инсульта, следует отметить, что они практически не изменились за последние 10 лет. Более того, в связи с распространением доказательной медицины многие пункты исчезли из протоколов [7]. В конечном счете ряд необходимых мероприятий в первые сутки заболевания сводится к быстрой госпитализации в течение 4 часов от его начала, выполнению методов нейровизуализации, определению подтипа ишемического инсульта и постановке вопроса о тромболитической терапии как единственно доказанном эффективном методе лечения [6]. Однако в реальных условиях специалисты чаще всего не имеют возможности проведения тромболитической терапии, эффективность которой наблюдается только в первые 3 часа заболевания, по причине несвоевременной госпитализации [5].

Ключевым вопросом в лечении инсульта является понимание важности изучения степени поражения мозговой ткани и гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Необходимо отметить, что данные по патофизиологии ишемического инсульта за последние годы существенно расширились. Известные изменения в зоне пенумбры, сформированные преимущественно под патологическим воздействием глутаматного каскада, и являются главной целью терапии ишемического инсульта [9]. Доказана общность патогенетических изменений как при ишемическом инсульте, так и при нарушениях мозгового кровообращения по геморрагическому типу и травмах мозга [7].

В последнее время все больше внимания привлекает диагностика, включающая определение нейронспецифических белков (НСБ), отражающих повреждение мозговой ткани, — биологически активных молекул, специфичных для нервных тканей. За последние 30 лет найдено и охарактеризовано более 60 различных НСБ [9]. При повреждениях мозговой ткани эти исследования помогают дифференцировать повреждения различных видов мозговой ткани. Наиболее обосновано использование теста НСБ для определения постишемических повреждений мозга [10]. На сегодняшний день наиболее перспективными маркерами повреждения центральной нервной системы и головного мозга являются:

— NSE (нейронспецифическая энолаза) — гликолитический нейронспецифический изофермент энолазы. Фермент присутствует в клетках нейроэктодермального происхождения, нейронах головного мозга и периферической нервной ткани. Наиболее обосновано использование теста NSE для определения постишемических повреждений мозга [8–10];

— GFAP (глиофибриллярный кислый протеин) является специфическим белком филаментовастроцитов; рост антител к нему сопровождает процессы патологического разрастания астроглиальных клеток (глиоз). Является одним из главных иммуноцитохимических маркеров астроцитов — представителей макроглии в центральной нервной системе (ЦНС). В качестве маркера астроцитов он широко применяется в диагностических целях и в экспериментальных работах при исследовании функций нервной системы в норме и при патологии [8–10]. Постоянно возрастающее число работ, посвященных астроцитам, связано с многообразием функций, которые, как установлено за последние два десятилетия, выполняют в ЦНС эти клетки [8].

Ряд исследований посвящен изучению активности нейронспецифичных белков при нейродегенеративных заболеваниях, черепно–мозговой травме и нарушениях мозгового кровообращения [9]. В зависимости от типа поражения нервной ткани (преимущественное поражение нейронов или глии) имеется возможность более точно корректировать интенсивную терапию в индивидуальном порядке, чтобы таким образом достичь дифференцированного подхода к терапии.

Как известно, мозговая ткань, отделенная ГЭБ, принадлежит к классу скрытых аутоантигенов [8]. На фоне разрушения ГЭБ, в результате ответа на ишемию мозговой ткани, толерантность к этим молекулам не возникает, и их попадание в кровоток может приводить к иммунному ответу, что влечет за собой развитие прямой цитотоксичности [13]. Авторы статьи считают, что перспективным методом в диагностике поражения мозговой ткани является изучение титров антител как к серому, так и к белому веществу. Возможность определения титра антител к мозговой ткани может коррелировать с изучением таких нейронспецифических белков, как нейронспецифическая энолаза (антитела к серому веществу) и глиофибриллярный кислый фибрин (белое вещество). Создание антигенного комплекса с последующим определением титра антител к серому и белому веществу головного мозга в острейшем периоде ишемического инсульта может быть реальной альтернативой использованию дорогостоящих и малодоступных маркеров повреждения ЦНС.

Цель исследования: улучшение диагностики функционального состояния головного мозга пациентов, находящихся в острейшем периоде ишемического инсульта, путем изучения уровней нейронспецифических белков, разработка мозгового антигена с последующим определением титра антител к серому и белому веществу головного мозга в первые 14 дней заболевания (острейший период).

Материалы и методы

В исследование, проведенное на базе ДОКТМО (г. Донецк), были включены 116 пациентов с диагнозом «острое нарушение мозгового кровообращения по ишемическому типу в острейшем периоде» (72 мужчины и 44 женщины). Возраст пациентов — от 36 до 69 лет. Объем исследования у пострадавших: клиническая оценка состояния больных, оценка по шкале комы Глазго и NIHHS, КТ головного мозга. Пациенты поступали в стационар не ранее чем через 7 часов от начала заболевания.

Для определения антител непосредственно к серому и белому веществу мозговой ткани впервые была разработана тест–система (ООО «Укрмед-Дон», г. Донецк). Определялись 2 класса антител к мозговой ткани (серому и белому веществу) — IgG и IgM. Результаты учитывались на анализаторе ChemWell 2910 (США) и выражались в единицах оптической плотности (OD). С целью определения степени тяжести поражения различных участков ткани головного мозга были определены уровни нейронспецифических белков (нейронспецифическая энолаза и глиофибриллярный кислый белок) методом иммунохимического анализа в острейшем периоде ишемического инсульта (на 1, 7 и 14-е сутки заболевания).

Интенсивная терапия у пациентов проводилась согласно приказам MЗ Украины № 487 и № 602 на базе отделения нейрореанимации ДОКТМО для больных с тяжелой степенью неврологического дефицита (оценка по шкале NIHSS более 13 баллов) и в отделении неврологии ДОКТМО для больных со средней степенью тяжести неврологического дефицита (оценка по шкале NIHSS менее 13 баллов). Пациенты методом случайных чисел были рандомизированы на 4 группы. Во всех случаях получено письменное информированное согласие пациента или родственников. Больные 1-й группы (тяжелая ст., 28 чел.) получали лечение с применением комплекса нейропротекции в дополнение к стандартной терапии. Больные 2-й группы (тяжелая ст., 32 чел.) получали стандартное лечение по приказу. Больные 3-й группы (средняя ст., 27 чел.) получали комплекс нейропротекции в дополнение к стандартной терапии. Больные 4-й группы (средняя ст., 29 чел.) получали стандартное лечение по приказу. В комплекс первичной нейропротекции входили препараты, направленные на восстановление реологических свойств крови, микроциркуляции, эндотелиальной дисфункции, функционального состояния нейроглии и гематоэнцефалического барьера: L-лизина эсцинат, латрен, реосорбилакт, препараты ГЭК, вторичной нейропротекции — препараты, влияющие на регенераторно–репаративные процессы в нейроцитах и клетках глии: тиоцетам, актовегин, цереброкурин, глиатилин, цитиколин [14].

Статистическая обработка данных проводилась с использованием методов описательной статистики в лицензионной программе MedStat. Результаты, полученные при p < 0,05, считались статистически значимыми (рис. 1–4).

Анализ результатов и их обсуждение

У пациентов всех групп на протяжении 2 недель (1, 2-е, 3-и, 4, 7, 10, 14-е сутки) лечения были определены титры антител (иммуноглобулины класса М и G). До 5-х суток терапии между группами с нейропротекцией и без нее не было достоверных различий. Однако начиная с 7-х суток в группе больных, получавших нейропротекцию, титр антител был достоверно ниже (p < 0,05). Подобные тенденции наблюдались в группах тяжелой и средней степени тяжести (с нейропротекцией и без нее) к белому и серому веществу головного мозга.

Относительно иммуноглобулина класса G следует отметить, что достоверных различий между группами средней степени тяжести, получавших и не получавших нейропротекцию, выявлено не было. Неинформативность иммуноглобулина класса G при средней степени тяжести инсульта связана с проявлением его максимальной активности к 3-й неделе заболевания, то есть по окончании острейшего периода заболевания.

После анализа титра антител класса M и G к белому и серому веществу головного мозга при помощи разработанного нами антигенного комплекса были определены уровни наиболее изученных биохимических маркеров повреждения ЦНС — NSE и GFAP.

На 1-е сутки во всех группах не было достоверно значимых различий. Однако на 7-е и 14-е сутки исследования в группах больных, получавших нейропротекцию, уровень указанных выше белков был достоверно ниже, чем в группах со стандартным лечением по приказу (р < 0,05). Кроме того, при сравнении в группах больных тяжелой и средней степени, получавших нейропротекцию, подтверждается тяжесть заболевания и правильность рандомизации по группам тяжести на основании шкалы комы Глазго и NIHHS. То есть в группах средней тяжести уровень NSE был достоверно ниже, чем в группе тяжелого инсульта (р < 0,05).

При изучении показателя глиофибриллярного кислого протеина была выявлена статистически достоверная разница между группами больных, получавших и не получавших нейропротекцию. Причем эта разница также появлялась после 5 суток (p < 0,05).

Очевидно, применяемый комплекс нейропротекции дает возможность не только блокировать патологические реакции ишемического каскада, но и восстановить гематоэнцефалический барьер, что позволяет достичь минимальной концентрации антител к мозговой ткани, снизить количество скрытого антигена и блокировать механизм иммуноцитотоксичности, а также уменшить уровень нейронспецифических белков в сыворотке крови уже к 5-м суткам заболевания.

То есть, осуществляя защиту мозговой ткани и зоны пенумбры с первых часов заболевания, предложенная нами терапия оказывает существенное влияние на состояние ЦНС и различных участков головного мозга к концу острейшего периода ишемического инсульта (р < 0,05).

Выводы

1. Впервые был синтезирован комплекс мозгового антигена с последующим определением титра антител к мозговой ткани в острейшем периоде ишемического инсульта.

2. Анализ динамики титра антител к серому и белому веществу головного мозга с 1-х по 14-е сутки терапии показал, что в группах пациентов (1 и 3), у которых применялась расширенная нейропротекция на 14-е сутки лечения, имунный ответ на повреждение головного мозга был статистически значимо ниже, чем в группах пациентов (2 и 4), у которых лечение проводилось согласно приказу МЗУ.

3. В группах с применением комплекса нейропротекции (1 и 3) улучшалось состояние астроцитарного и нейронального комплекса, функционирование ГЭБ в сравнении с группой пациентов без применения комплекса нейропротекции, что было определено при помощи изучения белков NSE и GFAP в динамике заболевания.

4. Разработанная нами тест-система мозгового антигена может быть использована как более доступная альтернатива дорогостоящим НСБ для диагностики состояния белого и серого вещества головного мозга и степени проницаемости ГЭБ в динамике, что даст более точную информацию о степени тяжести ишемического инсульта у пациента.

5. Определение уровня нейронспецифических белков NSE и GFAP позволяет более точно определить функциональное состояние мозговой ткани в текущий момент лечения у больных в острейшем периоде ишемического инсульта.


Bibliography

1. Goldstein L.B., Bushnell C.D., Adams R.J., Appel L.J., Braun L.T., Chaturvedi S., Creager M.A. Guidelines for the Primary Prevention of Stroke. A Guideline for Healthcare Professionals From the American Heart Association/American Stroke Association // Stroke. — 2010 Dec 2.

2. Guidelines for the Early Management of Adults With Ischemic Stroke. A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, in Research Interdisciplinary Working Groups, 2007.

3. Yarygin K.N., Skvortsova V.I. Mechanisms of positive effects of transplantation of human placental mesenchymal stem cells on recovery of rats after experimental ischemic stroke // Bull. Exp. Biol. Med. — 2009 Dec. —148 (6). — 862–8.

4. Stadler K. Peroxynitrite-Driven Mechanisms in Diabetes and Insulin Resistance — the Latest Advances // Curr. Med. Chem. — 2010 Nov 29.

5. Аванесян Р.А. Нейрофункциональные методы терапии (Биологическая обратная связь) в комплексном лечении невралгии тройничного нерва: Автореф. дис... канд. мед. наук. — М., 2009. — С. 18.

6. Нейротрофические факторы и антитела к ним: участие в развитии нейроиммунных реакций при различных нарушениях нервной системы / М.А. Грудень, В.В. Шерстнев, Н.М. Ефремова и др. // Нейроиммунология: мат-лы X конференции. — СПб., 2007. — С. 57.

7. Fellin T. et al. Endogenous nonneuronal modulators of synaptic transmission control cortical slow oscillations in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2009. — 106, 15037–15042. — 19706442.

8. Neuron-glia interactions: Glia make waves — Leonie Welberg; Nature Reviews Neuroscience, advance online publication, Published online 9 September 2009. — doi: 10.1038/nrn2724.

9. Алферова В., Гехт Б., Полетаев А.Б., Абросимова А.А., Беликова Л.П., Чумакова А.А., Николаева Т.Я., Гусев Е.И. Нейротропные естественные аутоантитела класса IgG в сыворотке крови больных с ишемическим инсультом // Журнал неврологии и психиатрии им. C.C. Корсакова. — 2008. — Т. 108, № 1. —  С. 56–60.

10. Черний Т.В., Натрус Л.В., Шлопов В.Г., Волос Л.И., Зяблицев С.В., Якубенко Е.Д. Разработка стратегии нейропротекции в эксперименте на модели черепно-мозговой травмы // Нейронауки: теоретичні та клінічні аспекти. — 2012. — Т. 8, № 2.

11. Повреждение головного мозга при тяжелой травме: значимость клинических шкал и нейрональных маркеров / Т.Г. Гришанова, А.В. Будаев, Е.В. Григорьев // Медицина неотложных состояний. — 2011. — № 1/2. — С. 86–90.

12. Zhu H., Dahlström A. Glial fibrillary acidic protein-expressing cells in the neurogenic regions in normal and injured adultbrains // J. Neurosci Res. — 2007. — 85. — 2783–2792.

13. Engelhardt B., Sorokin L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction // Semin. Immunopathol. — 2009 Nov. — 31 (4). — 497–511. — doi: 10.1007/s00281–009–0177–0. Epub 2009 Sep 25.

14. Ribotta M.G., Menet V., Privat A. Glial scar and axonal regeneration in the CNS. Lessons from GFAP and vimentin transgenic mice // Acta Neurochir. Suppl. — 2004. — 89. — 87–92.


Back to issue