Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.

International neurological journal 1 (87) 2017

Back to issue

Unconventional myosin 1c as autoreactive cells apoptosis marker in multiple sclerosis

Authors: Негрич Н.О.
Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, м. Львів, Україна

Categories: Neurology

Sections: Clinical researches

print version


Summary

З метою пошуку нових маркерів розсіяного склерозу (РС) було проведено порівняльний аналіз вмісту у сироватці крові хворих на РС та практично здорових донорів 48 кДа ізоформи неконвенційного міозину 1с (48 кДа Myo1c). Матеріали та методи. У дослідженні взяли участь 61 хворий на РС та 20 практично здорових осіб віком від 19 до 57 років. Методи дослідження. Клінічні — аналіз скарг, анамнезу захворювання та життя, загальний і неврологічний огляди; лабораторні — шляхом послідовного зсідання сироваткових білків, електрофорезу та цифрового аналізу отриманих електрофореграм у сироватці крові хворих на розсіяний склероз визначають вміст 48 кДа Myo 1c, при цьому наявність Myo1c підтверджують за допомогою вестерн-блоту з антиMyo1c антитілами. Результати та обговорення. У сироватках крові хворих на РС та здорових донорів виявили 48 кДа Myo1c. Встановили, що у сироватці крові хворих на РС рівень 48 кДа Myo1c був вірогідно вищим порівняно з групою практично здорових осіб. Зважаючи на те, що ключову роль в процесах набуття автореактивності при РС відіграють Т-лімфоцити, вірогідно підвищений рівень 48 кДа Myo1c, що міститься у значній кількості в активованих лімфоцитах, свідчить про посилену загибель цих клітин шляхом апоптозу. Визначили, що вік хворих у групі з високим рівнем 48 кДа Myo1c виявився вірогідно нижчим порівняно з групою із низьким рівнем цього білка. Натомість, достовірних статистичних закономірностей між рівнем 48 кДа Myo1c та розподілом хворих на РС за статтю не було виявлено. Висновки. Myo1c відіграє важливу роль у патогенезі РС, а його 48 кДа ізоформа може бути раннім діагностичним маркером цього захворювання, а також кількісним індикатором процесу апоптозу активованих автореактивних клітин, що, зокрема, є важливим для оцінки ефективності хворобомодифікуючої терапії.

С целью поиска новых маркеров рассеянного склероза (РС) был проведен сравнительный анализ содержания в сыворотке крови больных РС и практически здоровых доноров 48 кДа изоформы неконвенционного миозина 1с (48 кДа Myo1c). Материалы и методы. В исследовании приняли участие 61 больной с РС и 20 практически здоровых доноров в возрасте от 19 до 57 лет. Методы исследования. Клинические — анализ жалоб, анамнеза заболевания и жизни, общий и неврологический осмотр; лабораторные — путем последовательного осаждения сывороточных белков, электрофореза и цифрового анализа полученных электрофореграмм в сыворотке крови больных РС определяют содержание 48 кДа Myo1c, при этом наличие Myo1c подтверждают с помощью вестерн-блоттинга с анти-Myo1c антителами. Результаты и обсуждение. В сыворотке крови больных РС и здоровых доноров определили 48 кДа Myo1c. В сыворотке крови больных РС уровень 48 кДа Myo1c был достоверно выше в сравнении с группой практически здоровых доноров. Поскольку ключевую роль в процессах приобретения аутореактивности при РС играют Т-лимфоциты, достоверно повышенный уровень 48 кДа Myo1c, содержащегося в значительных количествах в активированных лимфоцитах, свидетельствует об усиленной гибели клеток путем апоптоза. Возраст больных в группе с высоким уровнем 48 кДа Myo1c оказался достоверно меньше в сравнении с группой больных, имеющих низкий уровень этого белка. Не были определены статистически значимые закономерности между уровнем 48 кДа Myo1c и распределением больных РС по половому признаку. Выводы. Myo1c играет важную роль в патогенезе РС, а его 48 кДа изоформа может служить ранним диагностическим маркером этого заболевания, а также количественным индикатором апоптоза активированных аутореактивных клеток, что является важным для оценки эффективности болезнь-модифицирующего лечения.

Comparative analysis to find the new markers of multiple sclerosis (MS) was conducted. The blood serum of multiple sclerosis patients and healthy donors was analyzed for 48 kDa unconventional myosin 1c (48 kDa Myo1c) isoform concentration. Materials and methods. Sixty one patients with multiple sclerosis and 20 healthy donors aged 19–57 years participated in the research. Methods of investigation: clinical (complaints, life and disease history, general and neurological examination), laboratory (identification of 48 kDa Myo1c in the blood serum by consequent serum protein sedimentation, electrophoresis and digital analysis of electrophoregrams; presence of Myo1c was confirmed by Western blot with anti-Myo1c antibodies). Results. In the blood serum of MS patients and healthy donors, 48 kDa Myo1c was identified. The group of MS patients had significantly higher level of serum 48 kDa Myo1c as compared to the control group. Considering the key role of T-lymphocytes in the autoreactive processes, higher level of serum 48 kDa Myo1c, that is present in great amounts in activated lymphocytes, results from increased apoptosis of these cells. The average age of patients with high levels of 48 kDa Myo1c was significantly lower in comparison to the group with decreased level of this protein. There were no significant correlations between 48 kDa Myo1c levels and sex detected. Conclusions. Myo1c plays an important role in MS pathogenesis, and its 48 kDa isoform may be used as an early diagnostic marker of MS, as well as quantitative indicator of apoptosis of activated autoreactive cells that is significant for the evaluation of disease-modifying treatment effectiveness.


Keywords

розсіяний склероз; апоптоз; маркер; неконвенційний міозин 1c

рассеянный склероз; апоптоз; маркер, неконвенционный миозин 1с

multiple sclerosis; apoptosis; marker; unconventional myosin 1c

Вступ

Розсіяний склероз (РС) є автоімунним запальним захворюванням центральної нервової системи (ЦНС), що характеризується ушкодженням мієлінової оболонки та дегенерацією аксонів [1]. РС — одна з основних причин інвалідизації молодих людей у цілому світі [2]. У глобальному плані РС призводить до значних матеріальних витрат і належить до соціальних захворювань [3].
Вважається, що Т-лімфоцити відіграють ключову роль у патогенезі РС. Внаслідок порушення центральної та периферійної імунної толерантності відбувається активація антигенпрезентуючими клітинами Т-клітин, що мають ознаки автореактивності щодо елементів ЦНС, що в кінцевому підсумку впливає на процес автоімунної демієлінізації [4].
Центральна толерантність полягає у «негативній» селекції Т-клітин у тимусі шляхом апоптозу Т-лімфоцитів, що виявили взаємодію між Т-клітинними рецепторами (ТКР) та власними пептидами головного комплексу гістосумісності (ГКГ) [5]. Вирішальне значення в даному процесі належить тимічним транскрипційним факторам автоімунної регуляції, що контролюють транскрипцію генів власного організму [6].
У випадку, якщо автореактивні Т-лімфоцити уникають механізмів центральної толерантності, спрацьовують периферійні: фізичне розділення автореактивних клітин та їх мішеней, видалення автореактивних клітин, їх інгібування (за рахунок відсутності костимулюючих факторів) або супресія регуляторними Т-клітинами [7]. 
Наївні Т-лімфоцити можуть активуватись лише шляхом отримання стимуляції через ТКР, корецептори чи цитокіни [8]. Якщо ж активація триває надто довго, або коли активований лімфоцит не знаходить тривалий час своєї мішені, він елімінується шляхом активаційно-індукованої загибелі клітин (АІЗК) [9].
Відомо, що один із механізмів дії препаратів хворобомодифікуючої терапії (ХМТ), зокрема β-інтерферонів і глатирамеру ацетату, а також високих доз глюкокортикоїдів, відбувається шляхом індукції процесу АІЗК в автореактивних клітинах [10, 11].
Хоч автоімунний патогенез РС є добре дослідженим, однак прогнозування та оцінка клінічного перебігу захворювання залишаються недосконалими. Саме тому ведуться пошуки нових маркерів, які б допомагали як у діагностиці самого РС, так і корелювали з особливостями його перебігу та могли б прогнозувати подальший розвиток хвороби, а можливо, пояснити етіологію патологічного процесу.
Останніми десятиліттями сироватка крові людини як нескінченно велике джерело біомаркерів активно досліджувалась. Це зумовлено, з одного боку, легким і малоінвазивним способом забору біоматеріалу (крові), з іншого — наявністю у ній більше ніж 10 тис. різних білків та їх фрагментів, що перебувають, здебільшого, у надзвичайно малих концентраціях. Саме тому вирішальне значення для ідентифікації цих протеїнів у сироватці крові має спосіб їх виявлення.
Нами було вперше виявлено та ідентифіковано у сироватці крові хворих на РС специфічний білок — 48 кДа ізоформу неконвенційного (позам’язового) міозину 1с (48 кДа Муо1с) [12]. Відомо, що Myo1c (молекулярна маса 121,7 кДа з базальною ізоелектричною точкою в 9,5), що є членом неконвенційного класу 1 міозину хребетних тварин, безпосередньо зв’язують плазматичну мембрану з мікрофіламентною кортикальною сіткою (цитоскелетом) [13, 14]. Myo1c бере участь у збереженні сталої структури цитоскелета, а отже, підтримує сталу форму клітин, а також задіяний у транспорті глюкози, рухливості клітин, ендоцитозі та ядерній транскрипції. Myo1c є одним з елементів, що контролюють цитоскелет-мембранну взаємодію та поверхневий мембранний тиск у В-клітинах. Цей білок функціонує в процесах руху клітин шляхом генерування або стабілізації ламелоподій і філоподій. Було показано, що Myo1c у великій кількості експресується у В-лімфоцитах, а саме в плазматичній мембрані, особливо в периферичних відростках, таких як мікроворсинки [13]. Доведено, що мікроворсинки, що розташовані на поверхні активованих В-клітин, здатні фіксувати деякі важливі молекули, такі як трансмембранні сигнальні білки, молекули міжклітинної адгезії-1 та головного комплексу гістосумісності класу II (ГКГ II) [15]. При цьому Myo1c відіграє роль ініціальної точки контакту для міжклітинних взаємодій. Отже, Myo1c може виступати як рецептор, селективно фіксуючи до поверхні мікроворсинок активованих В-лімфоцитів молекули адгезії та сигнальні білки.
Окрім цього, Myo1c бере участь у процесах презентації антигену. Це відбувається шляхом переміщення ліпідного шару та пов’язаних із ним молекул, особливо ГКГ II, через мембрану в місці контакту на стороні В-клітин. Таким чином, Myo1c сприяє формуванню імунологічного синапсу між антигенпрезентуючими клітинами (насамперед В- та Т-клітинами) [13].
Однак просте виявлення протеїнів, зокрема 48 кДа Myo1c, у сироватці крові без встановлення вірогідних залежностей між їх якісними та кількісними показниками й клінічними характеристиками РС не має практичного медичного застосування. Тому метою дослідження було проаналізувати рівень 48 кДа Myo1c у сироватках хворих на РС та порівняти його з показниками практично здорових осіб з метою пошуку вірогідних відмінностей, що дало б змогу перенести 48 кДа Myo1c з групи сироваткових білків у групу біомаркерів РС.

Матеріали та методи

Подана робота виконана на кафедрі неврології Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького та у Львівському обласному науковому центрі з вивчення проблем розсіяного склерозу та інших демієлінізуючих захворювань, що знаходиться на базі Львівської обласної клінічної лікарні.
Організація дослідження ґрунтувалася на положеннях Гельсінської декларації. Комісією з питань біомедичної етики Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького (протокол № 2 від 15 лютого 2016 р.) встановлено, що дане наукове дослідження відповідає етичним та морально-правовим вимогам згідно з наказом Міністерства охорони здоров’я України № 281 від 01.11.2000 р. Від усіх учасників дослідження було отримано письмову інформовану згоду на участь у дослідженні.
Критеріями включення пацієнтів у дослідження були: вік від 18 до 60 років, наявність вірогідного РС згідно з критеріями Мак-Дональда (2010) [16], відсутність прийому препаратів ХМТ і цитостатиків за останні 6 місяців, згода хворого на участь у дослідженні. Критерії виключення: вік менше за 18 років та понад 60 років, наявність супутніх захворювань, прийом препаратів ХМТ/цитостатиків останні 6 місяців, вагітність.
У дослідженні брали участь 61 хворий на РС віком від 19 до 57 років, середній вік яких становив 36,6 ± 1,4 року. Співвідношення жінок до чоловіків дорівнювало 2,4 : 1. Жінок було 43 особи (70,5 %), віком 19–57 років (середній вік — 37,0 ± 1,6 року). Чоловіків у дослідній групі було 18 осіб (29,5 %), віком від 20 до 52 років (середній вік — 35,8 ± 2,6 року).
Найменше хворих було віком до 20 років — 3 особи (4,9 %), а найбільше — віком понад 40 років (22 особи, 36,1 %). Частина осіб — це хворі віком 20,1–30 років (16 осіб, 26,2 %) та 30,1–40 років (20 осіб, 32,8 %).
Усіх хворих на РС умовно розподілили на 3 групи залежно від рівня 48 кДа Муо1с у сироватці крові. У першій групі показник був меншим за 0,01 мкг/мл (низький рівень), у другій — 0,01–8,00 мкг/мл (середній рівень), у третій — більшим за 8,00 мкг/мл (високий рівень). 
Контрольну групу становили 20 практично здорових осіб. Усі вони були одноразовими донорами Львівської обласної станції переливання крові середнім віком 33,2 ± 2,2 року. Детальне опитування, ретельний огляд і загальні лабораторні дослідження (біохімічний та загальний аналіз крові) дали змогу виявити відсутність в обстежених гострої та хронічної патології, а також наявність захворювань протягом останніх шести місяців. Виключено виробничий контакт зі шкідливими речовинами, ртуттю, марганцем, бензолом, толуолом та іншими сполуками, що мають вплив на нервову систему. Особам конт–рольної групи проводили імунобіологічне дослідження сироватки крові, зокрема визначали рівень 48 кДа Myo1c.
У дослідженні використали такі методи: клінічні — аналіз скарг, анамнезу захворювання та життя, детальний соматичний і неврологічний огляди з оцінкою ступеня інвалідизації за шкалою EDSS Куртцке [17]; лабораторні — шляхом послідовного зсідання сироваткових білків, електрофорезу та цифрового аналізу отриманих електрофореграм у сироватці крові хворих на розсіяний склероз визначали вміст 48 кДа Myo1c, при цьому наявність Myo1c підтверджували за допомогою вестерн-блоту з антиMyo1c антитілами [12]; інструментальні — МРТ головного та/або спинного мозку (лише для діагностики РС).
Статистична обробка отриманих результатів проведена за допомогою комп’ютерної програми Statistica 6.0 (StatSoft, Inc.). Першочергово нами було визначено нормальність розподілу в отриманих вибіркових сукупностях. Характер розподілу отриманих варіаційних рядів перевірено за допомогою критерію Шапіро — Уїлка, що засвідчив нормальний (гаусівський) характер розподілу даних.
При виконанні статистичної обробки отриманих даних було застосовано такі методи: розрахунок середнього арифметичного та його середньої похибки (М ± m); проведення оцінки вірогідності різниці отриманих результатів у порівнюваних групах; кореляційного аналізу — розрахунок парних коефіцієнтів кореляції за методом Пірсона.
Для оцінки вірогідності різниці отриманих результатів у аналізованих групах використовувався критерій Стьюдента. Даний метод був обраний тому, що розподіл у порівнюваних групах був нормальним (гаусівським), а в процесі аналізу порівнювались між собою дві групи спостережень. При порівнянні малих за чисельністю груп використовувалась таблиця Стьюдента для порівняння отриманих результатів при різному числі ступенів свободи з табличними значеннями. Відмінності визнавалися вірогідними при р < 0,05.

Результати та обговорення

У сироватках крові хворих на РС визначили вміст 48 кДа Myo1c та порівняли отримані результати з показниками контрольної групи (табл. 1).
Згідно з табл. 1, виявлено статистично вірогідну різницю між середнім рівнем 48 кДа Myo1c у сироватці крові хворих на РС і контрольною групою (p < 0,05). У групі хворих на РС середній рівень 48 кДа Myo1c виявився більше ніж в 11 разів вищим порівняно з групою практично здорових донорів.
Беручи до уваги той факт, що значна кількість 48 кДа Myo1c знаходиться в лімфоцитах, а особливо в активованих до антигену лімфоцитах [13, 14], ми вважаємо, що підвищений рівень 48 кДа Myo1c у сироватці крові хворих на РС зумовлений активаційно-індукованою загибеллю автореактивних клітин. 
Як відомо, патогенез РС минає в основному три стадії, що відповідають локалізації патологічного процесу в організмі: периферійної крові, гематоенцефалічного бар’єра та ЦНС [18]. На стадії периферійної крові відбувається активація імунних клітин до власних клітин організму (набуття автореактивності) [19]. Паралельно спрацьовують природні захисні механізми, одним із яких є АІЗК — процес елімінації з організму автореактивних клітин шляхом апоптозу. У цьому процесі вирішальне значення мають рецептор загибелі (Fas) та його ліганд (FasL). У нормі на поверхні лімфоцитів експресується лише Fas-рецептор. Натомість, під час активації починає експресуватись FasL, що запускає процес апоптозу через активацію каспази-8 [18].
Авторами також досліджено зміни рівня 48 кДа Myo1c у сироватці крові хворих на РС залежно від віку пацієнтів (табл. 2).
Відповідно до табл. 2, вік хворих у групі з високим рівнем 48 кДа Myo1c виявився вірогідно нижчим (27,83 ± 4,21 року) порівняно з групою із низьким рівнем цього білка (38,50 ± 1,64 року) (р < 0,05). Вік хворих статистично значущо обернено корелював із рівнем 48 кДа Myo1c у сироватці крові (r = –0,30; р < 0,05).
Активність імунної системи в осіб молодого віку є вищою порівняно з особами старшого віку [20, 21]. Тому вищий рівень 48 кДа Myo1c у хворих на РС молодого віку ймовірно пов’язаний із більш вираженою імунною відповіддю, а отже, із значнішою АІЗК.
У дослідженні визначили розподіл хворих на РС за статтю при різних рівнях 48 кДа Myo1c у сироватці крові (табл. 3).
Як подано у табл. 3, вірогідних статистичних закономірностей між рівнем 48 кДа Myo1c та розподілом хворих на РС за статтю не було виявлено. Спостерігалась тенденція до вищого співвідношення жінок до чоловіків у групі з високим рівнем 48 кДа Myo1c (5 : 1) порівняно з групами, в яких рівень цього білка був низьким і середнім (2,2 : 1). Очевидно, тенденція до даного гендерного розподілу при різних рівнях 48 кДа Myo1c пов’язана з вищою реактивністю імунної системи жінок [21].

Висновки

Таким чином, було встановлено, що в сироватці крові хворих на РС наявна 48 кДа форма Myo1c, рівень якої у сироватці крові хворих на РС є значно вищим порівняно з особами контрольної групи. 
Виявлено, що хворі на РС молодшого віку мали значущо вищий рівень 48 кДа Myo1c у сироватці крові порівняно із хворими старшого віку.
Myo1c відіграє важливу роль у патогенезі РС і може бути кількісним індикатором процесу апоптозу активованих автореактивних клітин, що, зокрема, є важливим для оцінки ефективності ХМТ.
Отже, 48 кДа Myo1c може бути раннім діагностичним маркером РС, завдяки якому можна встановити правильну стадію патологічного процесу та дібрати найефективніше лікування.
Конфлікт інтересів. Автор заявляє про відсутність конфлікту інтересів при підготовці даної статті.

Bibliography

1. Lassmann H, Brück W, Lucchinetti CF. The immunopatho–logy of multiple sclerosis: anoverview // Brain Pathol. — 2007. — Vol. 17. — P. 210-8. doi: 10.1111/j.1750-3639.2007.00064.x.
2. Соколова Л.И. К вопросу о современных методах диагностики и лечения рассеянного склероза // Мед. вестник. — 2008. — № 1. — С. 28-32.
3. Волошина Н.П., Левченко І.Л. Фармакоекономічне обґрунтування патогенетичного лікування розсіяного склерозу // Міжнародний неврологічний журнал. — 2006. — № 4. — С. 91-98.
4. Christine Riedhammer and Robert Weissert. Antigenpresentation, autoantigens, and immuneregulation in multiple sclerosis and other autoimmune diseases // Front. Immunol. — 2015. — Vol. 6. — P. 322. doi: 10.3389/fimmu.2015.00322.
5. Klein L, Klugmann M, Nave KA, Tuohy VK, Kyewski B. Shapingof the auto-reactive T-cell repertoireby a splicevariant of self protein expressed in thymicepithelial cell // Nat Med. — 2000. — Vol. 6. — P. 56-61. doi: 10.1038/71540.
6. Anderson MS, Venanzi ES, Klein L, et al. Projection of animmunological selfs hadow with in the thymusby the aire proteins // Science. — 2002. — Vol. 298. — P. 1395-401. doi: 10.1126/science.1075958.
7. Kamradt T, Mitchison NA. Tolerance and autoimmunity // N Engl J Med. — 2001. — Vol. 344. — P. 655-64. doi:10.1056/NEJM200103013440907.
8. Langrish CL, Chen Y, Blumenschein WM, et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune in flammation // J Exp Med. — 2005. — Vol. 201. — P. 233-40. doi: 10.1084/jem.20041257.
9. Cencioni MT, Santini S, Ruocco G, et al. FAS-ligand regulates differential activation-induced cell death of human T-helper 1 and 17 cells in healthy donors and multiple sclerosis patients // Cell Death and Disease. — 2015. — Vol. 6. — P. e1741; doi: 10.1038/cddis.2015.100.
10. Miljkovic´ D, Spasojevic I. Multiple Sclerosis: Molecular Mechanisms and Therapeutic Opportunities // Antioxid Redox Signal. — 2013. — Vol. 19(18). — P. 2286-334. doi: 10.1089/ars.2012.5068.
11. Шоробура М.С., Негрич Т.І., Стойка Р.С. Здатність імуноглобулінів сироватки крові хворих на розсіяний склероз різного віку (діти й дорослі особи) впливати на імунокомпетентні клітини // Міжнародний неврологічний журнал. — 2008. — Т. 2(18).
12. Myronovkij S, Negrych N, Nehrych T, et al. Identification of a 48kDa form of unconventional myosin 1c in blood serum of patients with autoimmunediseases // Biochemistry and Biophysics Reports. — 2016. — Vol. 5. — P. 175-179. doi: 10.1016/j.bbrep.2015.12.001.
13. Maravillas-Montero J, Gillespie P, Patin~o-Lo´pez G, et al. Myosin 1c participates in Bcelcytoskeletonrearrangements, isrecruited to the immunologic synapse, and contributes to antigenpresentation // J Immunol. — 2011. — Vol. 187(6). — P. 3053-3063. doi: 10.4049/jimmunol.1004018.
14. Bond LM, Brandstaetter H, Kendrick-Jones J, et al. Functional roles formyosin 1cincellular signaling pathways // Cell Signal. — 2013. — Vol. 5. — P. 229-235. doi: 10.1016/j.cellsig.2012.09.026.
15. Greicius G, Westerberg L, Davey EJ, et al. Microvilli structures on B lymphocytes: inducible functional domains? // Int. Immunol. — 2004. — Vol. 16. — P. 353-364. doi: 10.1093/intimm/dxh031.
16. Polman CH, Reingold SC, Banwell B, et al. Diagnostic criteriafor multiple sclerosis: 2010 revisions to the McDonald criteria // Ann Neurol. — 2011. — Vol. 69(2). — P. 292-302. doi: 10.1002/ana.22366.
17. Kurtzke JF. Rating neurologic impairment in multiple sclerosis: anexpanded disability status scale (EDSS) // Neurology. — 1983. — Vol. 33(11). — P. 1444-52. doi: 10.1212/WNL.33.11.1444
18. Xu G, Shi Y. Apoptosis signaling path ways and lymphocyte homeostasis // Cell Research. — 2007. — Vol. 17. — P. 759-771. doi: 10.1038/cr.2007.52.
19. Негрич Т.І. Дослідження впливу солумедролу на процес апоптозу при розсіяному склерозі // Укр. мед. часопис. — 2007. — № 3. — С. 54-60.
20. Евтушенко С.К., Москаленко М.А. Рассеянный склероз у детей. — К., 2009. — 385 с.
21. Confavreux C, Vukusic S. The clinical course of multiple sclerosis // Handb Clin Neurol. — 2014. — Vol. 122. — P. 343-69. doi: 10.1016/B978-0-444-52001-2.00014-5.

Back to issue