Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.

"News of medicine and pharmacy" Гинекология (253) 2008 (тематический номер)

Back to issue

Проблемы имплантации в программе IVF (обзор литературы)

Authors: И.Д. ГЮЛЬМАМЕДОВА, к.м.н., доцент кафедры акушерства, гинекологии и перинатологии ФИПО ДонНМУ им. М. Горького, О.К. МЕЖОВА, старший научный сотрудник НИИ медицинских проблем семьи ДонНМУ им. М. Горького

Categories: Obstetrics and gynecology

Sections: Specialist manual

print version

Состояние проблемы. Место методов вспомогательных репродуктивных технологий в лечении бесплодия

Проблема бесплодия не является отличительной чертой нашего столетия — она стара как мир. Так, уже в Библии упоминалось о бесплодных женщинах (Lunenfeld B., 1995). В то время верили, что плодовитость — это дар Господа, который можно получить или которого можно лишиться. Бесплодный брак остается одной из важнейших медицинских, социальных, экономических и общегосударственных проблем. По данным ВОЗ, его частота составляет 10–15 % и не имеет тенденции к снижению. Недостаточная эффективность методов восстановления естественной фертильности человека стимулировала развитие новых технологий, в том числе оплодотворения in vitro с последующим переносом эмбрионов в полость матки. Впервые метод был применен для лечения трубного бесплодия. Первая беременность, полученная после экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), была внематочной (Steptoe P.C., Edwards  R.G., 1976). Это знаменательное событие произошло в 1976 году благодаря научно-практическим исследованиям ученых P. Steptoe, R. Edwards, которые позднее, в 1978 году, получили первую маточную беременность после ЭКО. Эта беременность закончилась срочными родами (Steptoe P.C., Edwards R.G., 1978).

С этого момента началась новая эра в репродуктивной медицине. Суть метода ЭКО состоит в том, что из преовуляторных фолликулов аспирируются яйцеклетки, оплодотворяются сперматозоидами в лабораторных условиях, а полученные эмбрионы после короткого культивирования вне организма переносятся в полость матки пациентки. Метод прошел длительную эволюцию. Постоянно совершенствуются схемы и препараты для контролированной гиперстимуляции яичников, лабораторное оснащение и культуральные среды для эмбрионов, аппаратура для мониторинга роста фолликулов и забора яйцеклеток.

Возрастающий интерес к развитию вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) во всем мире обусловлен приоритетностью проблемы бесплодия в репродуктивной медицине. Ее социальное значение в нашей стране определяется неблагоприятной демографической ситуацией, в связи с чем сохранение и предупреждение нарушений репродуктивной функции населения приобрели в течение последних двух десятилетий первостепенное государственное значение. Однако, несмотря на большое количество поистине революционных достижений в этой сфере, результативность лечения бесплодия методом ЭКО колеблется от 20 до 60 % и редко преодолевает рубеж 30 % (Detsches IVF register, 1999). Стандартным методом контроля роста фолликулов в программах ЭКО является двухмерная, трансвагинальная эхография (ТВЭ) (Волик Н.К., 1999).

Основным диагностическим критерием оценки состояния эндометрия при 2D ТВЭ является его толщина (Kovach P. еt al., 2003). Эхографическая толщина эндометрия отображает степень подготовки эндометрия эстрогенами. Доказано, что в случаях, когда толщина эндометрия менее 5 мм, имплантация не происходит и перенос эмбрионов лучше не производить (Zaidi J. et al., 1995). В литературе описаны лишь единичные случаи наступления беременности, когда толщина эндометрия в циклах ЭКО была менее 5 мм (Sundstrom P., 1998).

Толщина эндометрия в пределах 5–7 мм является субоптимальной, то есть имплантация возможна, но ее вероятность низка по сравнению с толщиной эндометрия выше 7 мм. Идеальной толщиной эндометрия считается 9–12 мм (Zaidi J. et al., 1995). Часть исследователей отмечает лучший прогноз ЭКО-программ в случаях, когда толщина эндометрия не более 10 мм, в работах других авторов это не нашло подтверждения (Diettrich C. et al., 2002). Эхогенность эндометрия изменяется на протяжении менструального цикла. В фазе пролиферации эндометрий имеет так называемую трехлинейную — С-структуру. Повышение эхогенности эндометрия (В- и А-структура) в день назначения разрешающей дозы хорионического гонадотропина (ХГ) ассоциируется с низкой вероятностью имплантации, плохим прогнозом наступления беременности (Судома И.А. и др., 2004).

Классическими критериями зрелости фолликулов в циклах ЭКО при эхографии являются размер фолликулов и/или их объем (Brinsden P.R., 2005).

Считается, что при наличии 2–4 доминантных фолликулов от 16 до 22 мм можно назначать триггерную дозу хорионического гонадотропина.

В последние годы с целью мониторинга циклов ЭКО начали применять допплерографию. Кровоток в маточных артериях был впервые использован как маркер рецептивности эндометрия (Goswamy et al., 1998). Позднее в работах многочисленных авторов была доказана коррелятивная связь маточного и яичникового кровотока с фолликулогенезом и результативностью циклов ЭКО (Федорова Е.В., 2002).

По-прежнему спорным вопросом остается оптимальное время выполнения допплерографии. Часть исследователей оценивают маточный кровоток перед началом стимуляции гонадотропинами, другие авторы — в день назначения хорионического гонадотропина, в день забора ооцитов или в день переноса эмбрионов в полость матки. Нерешенным остается вопрос возможности отсрочки или отказа от переноса эмбрионов, если показатели маточного кровотока показывают, что имплантация маловероятна. Считается, что если достигнут пограничный уровень показателей допплерографии, прогноз нерецептивности эндометрия матки имеет специфичность (96–100 %), положительный прогностический уровень (88–100 %), однако низкую чувствительность (13–35 %) и низкое негативное прогностическое значение (44–56   %) (Friedler S. et al., 2006).

Несмотря на то что спиральные артерии имеют большое значение в обеспечении маточной перфузии, лишь небольшое количество работ посвящено их изучению (Kupesic S. е t al., 2002). Appelbaum (1998) описал 4 типа визуализации сосудов при допплерографии: 0 — сосуды визуализируются только в зоне миометрия; 1 — сосуды проникают за гиперэхогенный край эндометрия; 2 — сосуды достигают внутреннего гиперэхогенного края; 3 — сосуды достигают внутреннего края эндометрия (Appelbaum M., 1998). По данным авторов, отсутствие сосудов в эндометриальной зоне является абсолютным показателем негативного имплантационного прогноза, а у пациенток с проникновением сосудов к внутреннему краю эндометрия было получено наибольшее количество беременностей. Однако достоверной корреляции прогноза цикла ЭКО с параметрами кровотока и толщиной эндометрия авторам установить не удалось.

В последние годы появились работы, в которых показано, что способность ооцита к оплодотворению и дальнейшему росту и развитию эмбриона зависит не столько от размеров фолликула, сколько от его кровоснабжения (Bori-ni A. еt al., 2004). Так, в исследованиях A. Borini и соавт. было доказано, что количество полученных ооцитов достоверно коррелирует с индексом васкуляризации фолликулов (количество васкуляризированных фолликулов/общее количество фолликулов). Качество полученных эмбрионов коррелирует с PSV, в 70 % случаев при значении PSV более 10 см/с вероятно получение эмбрионов хорошего качества с высоким имплантационным потенциалом. J. Van Blerkom и соавт. в 2000 году доказали, что ооциты с дефектами цитоплазмы и эмбрионы с мультинуклеарными бластомерами происходят из фолликулов в состоянии гипоксии с плохим кровотоком. Гипоксия приводит к высокой частоте хромосомных аберраций. В этом исследовании был выявлен высокий индекс корреляции между фолликулярным кислородом, эндотелиальным сосудистым фактором роста и данными цветной допплерографии яичников в день назначения ХГ. Все эти показатели не зависели от размера фолликулов, то есть фолликулы одного размера могут иметь различный уровень насыщения кислородом. Авторы полагают, что фолликулы с интенсивным допплерографическим сигналом и перифолликулярным индексом резистентности менее 0,5 имеют высокий уровень кислорода (Van Blerkom J., 2000).

Разработка метода ЭКО вывела проблему лечения трубного бесплодия из тупика и позволила добиться наступления беременности у большого числа женщин, ранее обреченных на бездетность. Однако, согласно современным научным данным, среди супружеских пар, обращающихся с целью проведения программы ЭКО и переноса эмбрионов (ПЭ), большинство женщин и мужчин имеют отклонения в функциональном состоянии репродуктивной системы (Кулаков В.И., 2006; Адамян Л.В., 2006).

У данного контингента пациенток выявлена высокая распространенность субклинических и клинических форм эндокринопатий (91,7 %), в том числе нарушения пролактиносекретирующей и соматотропной функции гипофиза (30–40 %), функционального состояния щитовидной железы (до 50 %) и коры надпочечников (до 50 %).

В последние годы метод ЭКО-ПЭ все более широко применяется для лечения бесплодия у женщин с различными гинекологическими заболеваниями: наружным и внутренним эндометриозом, миомой матки, поликистозными яичниками и др. (Адамян Л.В., 2006).

Исходя из этих данных, проблема бесплодия в программе ЭКО должна рассматриваться применительно к репродуктивному здоровью супружеской пары в целом. Подобный подход меняет стратегию отбора и последующей подготовки к ЭКО супружеской пары с обязательной предварительной оценкой состояния репродуктивной системы каждого из супругов (Кулаков В.И., 2006).

Феномен наступления беременности. Имплантационные механизмы. Основные механизмы нарушения имплантации

Наступление беременности состоит из двух основных этапов:

1. Оплодотворение яйцеклетки, развитие и транспорт эмбриона. В программе ЭКО эти механизмы представлены контролированной гиперстимуляцией яичников, забором, оплодотворением ооцитов и культивированием эмбрионов in vitro.

2. Имплантация бластоцисты.

Подчас очень трудно ответить на вопрос, почему у некоторых пар имеются повторяющиеся неудачные попытки ЭКО. За редким исключением, большинство практических врачей объясняют повторяющиеся или необъяснимые неудачные попытки ЭКО плохим качеством эмбрионов, однако качество эмбрионов зависит в основном от качества гамет: зрелости цитоплазмы, целостности веретена деления ооцита; морфологии, подвижности и состояния ДНК спермы.

Качество ооцита — главный фактор, ограничивающий успех, так как именно в ооците происходят сложные трансформации, приводящие к появлению эмбриона. Половая клетка ооцит готовится к этому процессу в результате диалога с соматическими клетками гранулезы фолликула. В то же время извлечение ооцита путем пункции фолликула во время ЭКО значительно уменьшает этот диалог и изменяет развитие эмбриона in vitro (Antczac M., Van Blerkom J., 1997).

При беременности, наступившей естественным путем, очень большое значение имеет микроокружение эмбриона на разных стадиях его развития.

Фолликулярная жидкость

Фолликулярная жидкость участвует в заключительных этапах созревания ооцитов в фолликулах и трубах. Перед овуляцией фолликулярная жидкость контролирует последние транскрипционные и посттранскрипционные изменения, которые позволят эмбриону осуществить синтез белков на протяжении первых этапов деления и сегментации. Абсолютная роль фолликулярной жидкости в настоящее время мало изучена. Многочисленные факторы роста и цитокины присутствуют в преовуляторном фолликуле.

Пока что их роль глубоко не изучена.

Трубный и маточный секрет играет очень важную роль в развитии эмбриона. В течение 130–140 часов вплоть до самой имплантации эмбрион окружен этим секретом.

Трубная жидкость

Микроокружение эмбриона в трубе не является анатомически гомогенным. Различные анатомические участки трубы, вероятнее всего, имеют свою собственную секрецию. В то же время присутствие эмбриона модулирует эту секрецию. Эмбрион подает специфические сигналы для того, чтобы регулировать свой путь в матку (Barnea E.R., 2001; Grandolfi F., 1995; Noda Y., 1993; Ortiz M.E., 1986).

Биохимическое и иммунологическое равновесие, также как и анатомическое единство трубы нарушается инфекционной агрессией или воспалением (Dalton T. et al., 1994).

Микроокружение эмбриона в полости матки

К моменту входа эмбриона в полость матки объем секреции очень незначителен (несколько десятков микролитров), этот объем уменьшается параллельно увеличению секреции прогестерона. Клинические исследования с применением промывки полости матки в момент пункции яйцеклеток показывают, что выявление неадекватной секреции цитокинов, в частности интерлейкина-18 и фактора, ингибирующего лейкемию (ФИЛ), является признаком неадекватной рецептивности матки и позволяет предсказать потенциальное нарушение имплантации независимо от качества эмбрионов (Ledee-Bataille N., 2002).

После оплодотворения трудно изменить развитие эмбриона на ранних стадиях. Но существуют также и другие, не эмбриональные причины неудач, на которые, к счастью, в большинстве случаев можно влиять. Эти факторы следующие:

1) возраст женщин и иногда мужчин;

2) проблемы рецептивности матки, зависящие от состояния слизистой;

3) техника переноса эмбрионов (Chehab F.F., 1996).

Перед каждой попыткой ЭКО эти факторы должны быть определены.

Фолликулярный резерв яичников и качество ооцитов очень тесно взаимосвязаны между собой. Некоторые женщины рождаются с редуцированным запасом фолликулов, и снижение фертильности у них бывает очень ранним. К сожалению, на данном этапе этот процесс не поддается коррекции и предлагаемые различные протоколы стимуляции яичников (замена агонистов GhRH антагонистами, увеличение дозы ФСГ или чМГ) не улучшают прогноз.

В настоящее время уже уменьшилась спекуляция противопоставления ЭКО со стимуляцией суперовуляции получению яйцеклеток в естественном цикле. Сторонники применения ЭКО в естественном цикле полагают, что природа поступает лучше, чем мы (иногда это действительно так, но, к сожалению, чаще всего — если женщина молода).

Сторонникам спонтанного цикла необходимо напомнить, что 52 % ооцитов у молодых, нормально отвечающих женщин дисморфны (имеются нарушения морфологии) (Alikani M., 1995).

Что в этом случае можно думать о женщинах более старшего возраста, с тотальной недостаточностью яичников с точки зрения увеличения цитогенетической аномалии. Полученные в этом случае эмбрионы в большинстве случаев анэуплоидны (70–80 % после 42 лет) (Van Blerkom J., 2000). В этих случаях не нужно спекулировать тем, что высокие дозы ФСГ увеличат пропорцию нормальных ооцитов, это просто необоснованные психологические и материальные затраты.

Эндометриальные маркеры имплантации эмбриона человека. Рецептивность эндометрия

С развитием ВРТ многие пациентки, прежде считавшиеся безнадежно бесплодными, получили возможность зачать. Завершающим этапом всех процедур экстракорпорального оплодотворения ЭКО является имплантация бластоцисты после переноса женщине ее эмбриона. Сегодня хорошо известно, что успех имплантации зависит от временного соотношения между стадией развития эмбриона и периодом рецептивности эндометрия. Изучение особенностей функции и ультраструктуры эндометрия у человека в период имплантации занимало многих исследователей. Эндометрий подвергается постоянным изменениям в течение менструального цикла под воздействием эстрогенов и прогестерона в соответствии с изменениями их концентрации. Для успешного наступления имплантации развитие эндометрия и эмбриона должно быть синхронным. Можно предположить, что эмбрион, в свою очередь, также каким-то образом способствует созреванию эндометрия. Нарушения этого баланса могут изменить восприимчивость эндометрия и нарушить процесс имплантации.

Все внутриматочные повреждения нарушают рецептивность эндометрия. Все инфекционные и воспалительные заболевания, даже субклинические, обладают повреждающим эффектом. Инфекция является одной из главных причин как перинатальных осложнений, так и нарушений имплантации. Может ли в этом случае простая диагностическая гистероскопия с последующим антибактериальным или противовоспалительным лечением изменить прогноз неудачных попыток ЭКО и необъяснимого привычного невынашивания?

Кроме того, аденомиоз, субмукозная миома матки, многочисленные циклы индукции овуляции кломифена цитратом могут нарушить имплантацию. Учитывая, что имплантация эмбриона является следствием сложного диалога между трофобластом и эндометрием с вовлечением многочисленных провоспалительных цитокинов, не удивительно, что многочисленные неудачные попытки ЭКО и повторяющиеся самопроизвольные аборты связаны с иммунологическими нарушениями. В списке «виновников» находятся антифосфолипидные, антитиреоидные антитела и очень большое значение имеют активированные естественные киллеры — NK (natural killer). Необходимо, однако, отметить, что относительно роли антифосфолипидных антител имеются очень противоречивые публикации. Многочисленные работы подчеркивают роль Th1-цитокинов (синтезируемых активированными NK) и цитотоксических лимфоцитов у женщин с привычным невынашиванием и неудачными попытками ЭКО.

И, наконец, обнаружена корреляция между наличием антитиреоидных антител и цитотоксичных цитокинов при повторяющихся выкидышах. Лечение с применением кортикостероидов не всегда дает желаемые результаты и не лишено нежелательных вторичных эффектов. Применение гепарина и внутривенное введение иммуноглобулинов имеет различную эффективность.

Важной проблемой остается вопрос идентификации периода максимального соответствия развития эмбриона и восприимчивости эндометрия. Фаза имплантации наиболее критическая при проведении ЭКО. Развитие эмбриона зависит от внутриматочной среды, но в то же время сигналы от эмбриона модулируют дифференциацию эндометрия. Эта синхронизация называется окном имплантации (Bergh P.A., 1992).

Еще в 1945 году P. Vigano и соавт. провозгласили такой афоризм: «Бластоциста может виртуально имплантироваться в любом месте человеческого организма, кроме нерецептивного эндометрия» (Vigano P., 2004). Перенос эмбрионов будет безуспешным, если отсутствует синхронизация между стадией развития эмбриона и эндометрия. Парадоксально, но приходится констатировать, что имплантация может наступить в любой ткани человеческого тела (при спонтанной или экспериментальной внематочной беременности) чаще всего без всякой предварительной подготовки этой ткани. В то же время эндометрий относится к числу тех редких тканей, где имплантация невозможна, за исключением окна имплантации (Delage G. et al., 1995). В этот период эндометрий максимально чувствителен к рецепции эмбриона. Предполагают, что у женщин этот период составляет 4 дня — с 20-го по 24-й день нормального менструального цикла и, следовательно, со дня сдачи лютеинизирующего гормона (ЛГ) + 7 до дня ЛГ + 11 (Acosta A.A., 2000). В последние десятилетия доказано, что это окно имплантации практически всегда зависит от координированной экспрессии химиокинов, металлопротеаз, молекул адгезии, маточной и плацентарной экспрессии факторов роста (Evain-Brion D., 1999; Merviel P., 1998), так же как и провоспалительных цитокинов, которые обеспечивают стадию аппозиции, затем адгезии, регулируют базальную инвазию плацентарного конуса, затем обеспечивают и регулируют как адгезию, так и инвазию клеток трофобласта в эндометрий (Chaouat G. et al., 1995; Chard T., 1995; Giudice L.C., 1994; Lessey B.A., 1995; Mcmaster M.T., 1992; Tabibzaden S., 1995).

Эта координированная экспрессия для некоторых медиаторов является полностью или частично гормональнозависимой от начала цикла до овуляции, когда секреция эстрогенов в дальнейшем сменяется смешанной эстрогено-прогестероновой. Под влиянием прогестерона эндометрий подвергается структурным и молекулярным модификациям, позволяющим эмбриону имплантироваться во время окна имплантации (Aplin J.D., 2000). Во время лютеиновой фазы на уровне различных структур происходит серия изменений — речь идет об эпителии желез и поверхности полости матки, клеток стромы сосудов и внеклеточного матрикса. К сожалению, оптический и даже электронный микроскоп не позволяет выявить никакой разницы в предимплантационный период у фертильных и бесплодных женщин. С 1950 года существует очень точная анатомо-морфологическая хронологическая система характеристики эндометрия, предложенная R.W. Noyes в 1975 году. Выявлено, что существует рассогласование между хронологической и гистологической датацией эндометрия. Эндометрий, исследуемый в лютеиновую фазу, может быть «в фазе» или «вне фазы». Существует расхождение более чем в 3 дня между фазой цикла и морфологическим строением. Взаимосвязь между этими морфологическими изменениями и рецептивностью эндометрия некоторыми исследователями отрицается (Barash A. et al., 1992; Castelbaum  A.J. et al., 1994).

В то же время в работах других авторов доказана полезность этой датации (хронологии) и ее связь с бесплодием (ASRM, Seattle, 2002).

У животных синхронизация может быть развязана с отсрочкой на неопределенное время: например, наиболее изученная модель, с точки зрения американцев, — весенняя синхронизация и возобновление деления эмбрионов пост-бластоцисты и дифференциация матки.

У человека окно имплантации очень мало изучено по ряду причин, среди которых доминируют технические и этические факторы. В действительности никакая модель in vitro не способна восстановить сложность динамического клеточного взаимодействия, активизирующего эпителиальные, стромальные иммунокомпетентные клетки, представленные в эндометрии на протяжении окна имплантации, необходимые для процесса аппозиции-адгезии и инвазии.

Наконец, чаще всего когда мы изучаем тонкое строение эмбриона, это приводит к его деструкции, и мы не можем изучить имплантацию именно этого эмбриона. Практика биопсии эндометрия у человека в периимплантационный период нежелательна. Наконец, напомним, что существует только одна модель приматов, наиболее приближенная к человеческому виду, — шимпанзе, но этот вид имеет статус защищенного красной книгой и очень трудно получить разрешение на проведение исследований на этом животном в области репродукции, так как приоритетными являются исследования, посвященные вакцинации против ВИЧ.

Таким образом, процесс имплантации различен у разных видов, и данные исследований на животных не всегда применимы к человеку. Существуют определенные практические и этические сложности изучения процесса имплантации эмбриона человека в условиях in vivo. Поэтому данные об имплантации эмбриона человека весьма ограничены. Доступная информация основана на раздельном изучении эндометрия и бластоцисты на моделях in vitro.

Гормоны и рецептивность эндометрия. Исследование эндометриальных пиноподий

Половые стероиды абсолютно необходимы для пролиферации и децидуализации эндометрия и подготовки его к имплантации эмбриона (Gonzalez R.R. et al., 2000).

Все основные процессы роста и созревания эндометрия регулируются представителями стероидных гормонов эстрадиолом (Е2) и прогестероном (Goswamy et al., 1988; Grandolfi F., 1995).

Эти маленькие гидрофобные молекулы попадают в клетку-мишень благодаря простой диффузии. Внутри клетки медиаторами их действия являются специальные ядерные рецепторы — протеины, рецепторы эстрадиола и прогестерона. Рецепторы стероидных гормонов по своей структуре являются фосфопротеинами, а при наличии гормона происходит гиперфосфориляция рецепторов (Griesinger G., 2000).

Стероидные рецепторы непосредственно влияют на генную транскрипцию, связываясь со специфическими последовательностями ДНК. В ответ на эстрогены или прогестерон стероидные рецепторы могут связываться с эстроген- или прогестеронреагирующими (ответственными) элементами ДНК и активируют или останавливают транскрипцию (Hambarlsoumlan E., 2002).

Кроме того, стероидные молекулы могут оказывать влияние на генную экспрессию не прямо, а через промежуточные молекулы. На моделях животных было показано, что эстрадиол стимулирует транскрипцию и синтез как рецепторов эстрогена (РЭ), так и рецепторов прогестерона (РП) в матке. Прогестерон, напротив, подавляет экспрессию (Hambarlsoumlan E., 1998) эстрогенреагирующего элемента, который находится внутри кодирующей порции гена.

Уровни м-РНК не изменяются на протяжении менструального цикла в эндометрии человека, несмотря на циклические вариации количества РП (Hambarlsoumlan E., 1997; Harvey M.B., 1995).

Это свидетельствует о посттранскрипционной регуляции экспрессии РП. Оба типа рецепторов (РЭ и РП) регулируются эстрадиолом и прогестероном по клеточно-специфическому принципу. Недавно был открыт второй рецептор эстрогенов — РЭβ, в связи с чем другой, уже известный рецептор был назван РЭα. РЭα экспрессируется в основном в матке, яичниках, гипофизе, почках, надпочечниках, яичках, эпидидимусе, а РЭβ — в предстательной железе, мочевом пузыре, костях, головном мозге, яичниках (клетки гранулезы) и яичках (развивающиеся спермадиты). Существует также две изоформы РП — РПα и РПβ.

Количество эстрогеновых и прогестероновых рецепторов изменяется на протяжении менструального цикла. В ранней пролиферативной фазе РЭ и РП отсутствуют в железистом эпителии, но оба рецептора экспрессируются в стромальных клетках. Затем на протяжении регенерации и реконструкции эндометрия они появляются во всех клетках. Во время фолликулярной фазы ядерная локализация рецепторов отмечается в эпителии и строме.

Предовуляторный подъем Е 2 обеспечивает образование рецепторов к прогестерону, гормону, необходимому для гестации. Существует значительная разница между количеством рецепторов в периовуляторный и периимплантационный периоды (Hey N.A., 1994).

У пациенток с гинекологическими заболеваниями отмечается аномальная экспрессия РЭ и РП в эндометрии (Hilton D.J., 1991).

Прогестерон обеспечивает секреторную активность эндометрия, обеспечивая благоприятную среду для развития эмбриона и его имплантации. Секреторная трансформация эндометрия, вызванная прогестероном, сопровождается каскадом экспрессии генов, которые облегчают или, напротив, ограничивают имплантацию эмбриона. Яичниковые стероиды играют роль медиаторов в диалоге «эмбрион — матка» и модулируют экспрессию многочисленных факторов роста, цитокинов или молекул адгезии в материнско-плодовом пространстве. Среди этих гормонов некоторые, похоже, играют фундаментальную роль, например такие как прогестерон, Е2, а также хорионический гонадотропин человека (чХГ), ингибины, активин, релаксин, кальцитонин. Возможно, чХГ — одна из первых сложных молекул, синтезируемых эмбрионом. Он принимает участие на всех этапах диалога «эмбрион — матка». Однако ни один из этих гормонов или их рецепторов нельзя расценивать как маркер рецептивности эндометрия. Изолированное определение рецепторов к эстрогенам или прогестерону, проводимое у бесплодных женщин в момент пункции ооцитов, не позволяет абсолютно точно прогнозировать, будет имплантация или нет (Hodgen G.D., 1980).

Лептин, кодируемый геном ob, действует через гипоталамус на жировую ткань человеческого тела, играет значительную роль в процессе имплантации. Действительно, мыши ob–/– бесплодны, фертильность у них восстанавливается после инъекции рекомбинантного лептина (Ingamells S., 1996). У женщин уровень циркулирующего лептина максимальный в лютеиновую фазу (Ingamells S., 1996). Лептин и его рецепторы продуцируются эндометрием и плацентой (Jurisicova A., 1995). Этот гормон участвует в диалоге «матка — эмбрион» и модулирует инвазивные характеристики цитотрофобласта (Ka-yisll U.A., 2002).

Исследование эндометриальных пиноподий

Как показано многими исследователями, имплантация наступает только тогда, когда эндометрий, находящийся под определенным гормональным воздействием, вступает в фазу восприимчивости к имплантации бластоцисты (Kerr J.F.R., 1972; King A., 1999; Kokawa K., 2001).

Эта фаза достаточно короткая и должна совпадать с развитием эмбриона до стадии бластоцисты, определяя, таким образом, короткий интервал времени, когда возможна имплантация. Период, в течение которого эндометрий остается рецептивным для нидации эмбриона, получил название «окно имплантации». Предполагаемое окно имплантации человека теоретически совпадает с 20–22-м днем идеального 28-дневного менструального цикла (Kovach P., 2003).

Опыт работы в программе донорства яйцеклеток показал, что женщины, получающие заместительную гормональную терапию (ЗГТ) с последующим переносом эмбриона, имеют даже несколько выше шанс на успешную имплантацию, чем пациентки, проходящие стандартное ЭКО (Kupesic S., 2002; Kwak J.Y., 2000; Laird S.M., 2000; Lante-ri E., 1998), вероятно, за счет влияния гормонов и лучшей координации времени переноса эмбриона, что возможно в циклах с ЗГТ. Важно учесть, что оптимальное время для переноса эмбриона в этих циклах ограничено и не превышает 3 дней. Так, для эмбриона 2-го дня благоприятный период находится между 3-м и 5-м днем приема прогестерона (Lass A., 2001). Перенос эмбриона вне этого времени не приводит к его имплантации. Логично предположить, что это связано с ограниченностью периода восприимчивости эндометрия. Таким образом, стала ясна настоятельная необходимость открытия какого-либо маркера восприимчивости эндометрия человека к имплантации бластоцисты. Методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) поверхностного эпителия эндометрия мышей и крыс было выявлено наличие характерных выпячиваний апикальной части плазматической мембраны поверхностного эпителия в период имплантационного окна (Ledee-Bataille N., 2002; Lessey B.A., 2000; Lessey B.A., 1996).

В это время мембраны теряют свои микроворсинки и формируют гладкие выпячивания. Эти образования, как было показано на грызунах, участвуют в абсорбции маточного секрета (Lessey B.A., 1995), и поэтому они были названы «пиноподии» (от греческого pino — пить, podes — нога).

В эндометрии человека также было показано наличие аналогичных пиноподиям структур, появляющихся в середине лютеиновой фазы. Определение пиноподий было предложено как один из маркеров рецептивности эндометрия (Licht P., 2001; Lunenfeld B., 1995; Mar-tel D., 1981).

Для их изучения было проведено исследование большого количества образцов эндометрия, полученных у здоровых добровольцев — женщин, получающих стимуляцию яичников в рамках программы ЭКО, а также у женщин с искусственным циклом, получавших эстрадиол и прогестерон. Контроль стадии цикла проводился методом ультразвукового исследования и определения пика лютеинизирующего гормона в моче и сыворотке крови. Биоптаты фиксировали и подготавливали для СЭМ по описанной методике (Mcmaster M.T., 1992).

Эволюция морфологии клеток поверхностного эпителия следует определенной схеме, что дает возможность датировать биоптат секреторного эндометрия с точностью до 24–48 часов. Первые признаки формирования пиноподий представляют собой выраженное вздутие клеток, сочетающееся с исчезновением микроворсинок (МВ). Затем формируются гладкие и тонкие выпячивания мембраны, поднимающиеся со всей верхушки клетки (развивающиеся пиноподии). Вскоре после того как МВ полностью исчезают, выпячивания достигают своей максимальной величины и образуют складки или грибы (развитые пиноподии). Эта стадия длится менее 48 часов. Затем вздутие клеток уменьшается, и кончики МВ вновь появляются на поверхности мембран, которые становятся сморщенными, в то время как сама клетка начинает увеличиваться в размере (так называемый регресс пиноподий). Как выяснилось, эти изменения клеток возникают в вышеописанной последовательности во всех типах изученных циклов, а продолжительность существования развитых пиноподий обычно не превышает 2 дня. Однако конкретный день их формирования может варьировать у разных женщин. В естественных циклах развитие пиноподий наблюдается в дни пика ЛГ + 6–9 (19–22-й дни) у различных индивидов, в среднем на 20-й и 21-й дни цикла (Merviel P., 1998; Meseguer M., 2001).

В циклах стимуляции яичников в программе ЭКО развитые пиноподии формировались на 18–22-й дни цикла (получение яйцеклеток на 14-й день) у различных женщин в зависимости от особенностей протоколов стимуляции. В большинстве случаев зрелые пиноподии наблюдались уже на 19-й день, что являлось достоверной акселерацией развития примерно на 1–2 дня по сравнению с естественными циклами (Metkalf D., 1991; Murphy C.R., 2000; Murray R., 1990; Ledee-Bataille N., 2006; ASRM, Seattle, 2002; Nikas G., 1995, 1999).

В искусственных циклах день появления развитых пиноподий варьировал у женщин в промежутке до 3 дней (20–22-й дни цикла, или прогестерон 6–8) (Nikas G., 1999). В данном случае 1-й день назначения прогестерона считался днем П1. Формирование пиноподий практически не исследовалось у пациенток с аденомиозом. Примечательно, что в единственном доступном исследовании у пациенток с диагнозом «эндометриоз» (средней и тяжелой степени) не было выявлено никаких отклонений в формировании пиноподий (Nikas G., 1999). Взаимосвязь между наличием пиноподий и исходом имплантаций была исследована в 17 искусственных циклах, предваряющих перенос донорских эмбрионов (Nikas G., 1995).

В исследование были включены только случаи с эмбрионами хорошего качества. В зависимости от количества пиноподии оценивались как изобилующие, умеренные и немногочисленные в зависимости от процента занимаемой ими поверхности эндометрия (> 50, 20–50 и < 20 соответственно). У всех 5 пациенток с изобилующими пиноподиями наступила беременность, 3 из 7 женщин с умеренным числом пиноподий также забеременели, в то время как ни у одной пациентки с малым количеством или с отсутствием пиноподий беременность не наступила (Nilsson O., 1962).

Таким образом, можно подвести итоги — у женщин с нормальным менструальным циклом пиноподии появляются между 19–21-м днями менструального цикла, во время предполагаемого окна имплантации (Nilsson O., 1966). Если говорить более точно, они открывают это окно, но, похоже, не присутствуют на всем его протяжении. Их появление абсолютно зависит от наличия прогестерона, а период полужизни длится менее 48 часов с вариациями у разных пациенток в зависимости от гормонального фона (Nilsson O., 1958). Стимуляция яичников, похоже, ускоряет появление пиноподий, в то время как гормональная заместительная терапия тормозит их появление по отношению к нормальному циклу (Noda Y., 1993).

Существует корреляция между числом пиноподий и имплантаций после переноса эмбрионов. Точная роль пиноподий пока что не доказана. Появление пиноподий, похоже, связано с феноменом аппозиции бластоцисты эпителию в просвете эндометрия. И, наконец, их появление связано с появлением молекул — участниц имплантации, например интегринов, или секрецией эпидермального фактора роста, который появляется в середине лютеиновой фазы (Noyes R.W., 1975).

Необходимо отметить, что в литературе имеются несколько противоречивые сведения относительно появления и продолжительности периода существования пиноподий. Как считают R. Uzadi и соавт. (O'Malley B.W., 1992), несмотря на то что пиноподии, очевидно, представляют собой определенную модификацию поверхности эндометрия, важную для имплантации, время их формирования на клетках поверхностного эпителия отчетливо выходит за пределы предполагаемого окна имплантации. A. Acosta и соавт. в своем обширном исследовании также показали несколько отличающиеся результаты: истинные пиноподии появляются небольшими группами с 20-го дня цикла и остаются до конца секреторной фазы (Oenler M.K., 2000).

Эти разногласия можно объяснить следующим образом. В позднюю секреторную фазу клетки поверхностного эпителия эндометрия подготавливаются к отторжению во время менструации. Это проявляется в виде увеличения (набухания) клеток и может быть ошибочно принято за «долгоживущие пиноподии» (Olivennes F., 2002). Эти клетки неодинаковы по размерам и кажутся потрескавшимися или сморщенными в результате апоптоза и некротических изменений, в чем заключается их отличие от истинных пиноподий. В исследованиях других авторов всегда наблюдалось отсутствие истинных пиноподий уже после пика ЛГ + 10 дней (Ortiz M.E., 1986; Parker M.G., 1998), что согласуется с другими данными (Paulson R.I., 1990; Plachot M., 2000; Polgar K., 2002; Psychoyos A., 1971, 1973, 1994; Quinton R.R., 1999; Racowsky C., 2002; Remoni J., 1993; Ren S.G., 1997; Sargent I.L., 1998; Sharpe-Timms K.L., 2001; Shervin J.R., 2002; Simon C., 2001; Somkuti S.G., 1997).

В настоящее время единственным достоверным методом изучения пиноподий является электронная микроскопия. Пиноподии могут быть визуализированы также под световым микроскопом как выпуклые апикальные выпячивания клеток (Aghajanova L., 203; Develioglu O.H., 2000), однако лимитирующими факторами являются низкое разрешение световой микроскопии и невозможность исследования больших участков тканевого среза.

Неясной остается роль пиноподий в процессе имплантации. В отличие от грызунов в эндометрии человека пиноподии не участвуют в абсорбции жидкости из полости матки (Adams S.M., 2002). Исходя именно из этого факта, C. Murphy предложил именовать плазматические выпячивания не пиноподиями, а ютеродомами (uterodomes), что, по его мнению, наиболее четко отражает происхождение и не затрагивает описание функциональных качеств клеточных образований (Murphy C.R., 2000).

Тем не менее связь пиноподий (сегодня это название является общепринятым) с факторами роста и другими биологически активными веществами предполагает их возможное непосредственное участие в механизме имплантации. Со своей апикальной поверхности они, например, могут стимулировать клеточную пролиферацию и инвазию эмбриона и способствовать децидуализации эндометрия.

Вариабельность появления пиноподий от одного цикла к другому, необходимость биопсии во время окна имплантации, а также необходимость электронной микроскопии ограничивают широкое клиническое применение этого маркера. Дальнейшее исследование факторов имплантации позволяет углубить понимание процесса имплантации и идентифицировать маркеры периода имплантационного окна. В идеале они должны определяться неинвазивным методом, что позволило бы проводить перенос эмбриона в том же цикле. Сегодня клиническое исследование эндометрия на наличие пиноподий является эффективным, но инвазивным методом оценки эндометриального статуса. Обычно оно производится в естественном цикле после нескольких неудачных циклов ЭКО. Проводить перенос в этом же цикле не представляется возможным, а состояние эндометрия в стимулированном цикле все же несколько отличается от такового в естественном цикле.

Коэкспрессия пиноподий с другими маркерами восприимчивости эндометрия

1. Коэкспрессия пиноподий и стероидных рецепторов.

Формирование пиноподий в эндометрии человека в предымплантационный период и одновременную выработку некоторых биологически активных веществ изучали в биоптатах, полученных у одних и тех же женщин.

Были досконально изучены стероидные рецепторы эндометрия. Так, определено, что в середине секреторной фазы происходит уменьшение числа рецепторов прогестерона (Oenler M.K., 2000).

Появление же зрелых пиноподий совпадает с резким снижением степени иммуноокрашивания на рецепторы прогестерона в эпителии и с образованием плато концентрации прогестерона в крови. Раннее формирование пиноподий в стимулированных циклах сопровождалось ранним снижением уровня рецепторов прогестерона и четко соотносилось с преовуляторным повышением уровня прогестерона выше 6 нг к 13-му дню (Develioglu O.N., 1999; Stavreus-Evers A., 2001).

2. Коэкспрессия пиноподий и фактора, ингибирующего лейкемию.

Очень важным звеном имплантации эмбриона является фактор, ингибирующий лейкемию (ФИЛ). Интересные данные были получены при изучении ультраструктуры поверхностного эпителия человеческого эндометрия и экспрессии фактора, ингибирующего лейкемию (leukemia inhibitory factor), в одном и том же образце ткани (Aghajanova L., 2003).

Была выявлена корреляция экспрессии ФИЛ и его рецептора и присутствия пиноподий на поверхности человеческого эндометрия (Aghajanova L., 2003).

Причем максимальная экспрессия цитокина и рецептора совпадала со стадией расцвета пиноподий, что соответствовало предполагаемому периоду имплантации бластоцисты. Можно предположить, что ФИЛ выделяется в виде своей трансмембранной формы в полость матки, где он взаимодействует с поверхностью бластоцисты.

Роль фактора, ингибирующего лейкемию, в репродукции человека

В последнее время внимание многих ученых привлечено к изучению роли цитокинов в системе репродукции человека. Цитокины — это биологически активные вещества, полипептиды, играющие важную роль в функции клетки и в передаче сигналов. Фактор, ингибирующий лейкемию — один из наиболее интересных с точки зрения репродуктивной функции животных и человека цитокинов.

ФИЛ , или leukemia inhibitory factor (LIF), впервые был идентифицирован в 1986 г . Metkalf и коллегами в Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Melbourne, Australia (Metkalf D., 1991).

ФИЛ представляет собой высокогликолизированный полипептид с молекулярной массой 20 000, который кодируется геном, локализованным у человека в хромосоме 22q12. Ген ФИЛ не проявляет гомологичности ни с одним из известных факторов роста или цитокинов.

ФИЛ в норме продуцируется различными видами клеток, включая фибробласты, клетки гемопоэтического ряда, гепатоциты, эндотелиальные клетки, сенсорные и автономные нервные клетки, остеобласты, астроциты некоторые необластические клетки (Metkalf D., 1991). Эффекты ФИЛ в различ- ных физиологических системах включают пролиферацию, дифференциацию клетки (Hilton D.J., 1991). Потенциальными индукторами синтеза ФИЛ являются интерлейкин-1 (IL-1), фактор некроза опухоли (TNF), эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста (TGF) (Auernhammer P., 2000).

Механизм действия ФИЛ включает активацию двух компонентов: ФИЛ-специфического рецептора и мембранного рецептора гликопротеина gp130. Связывание с высокоспецифическим ФИЛ-рецептором не конкурируется ни с одним из известных факторов роста или цитокинов, чем обусловлены многие уникальные функции ФИЛ. В то же время gp130 служит рецептором также для родственных цитокинов IL-6, IL-11, онкостатина М, CNTF и CT-1, чем объясняется частичное дублирование многих эффектов ФИЛ указанными цитокинами (Амбарцумян Э.М., 2004).

Было обнаружено, что ФИЛ in vitro поддерживает эмбриональные стволовые клетки в недифференцированном состоянии, ингибируя их дифференциацию, но не влияя на пролиферацию клеток (Амбарцумян Э.М., 2004).

Таким образом, выяснилось, что ФИЛ является первым протеином, способным влиять на фенотип эмбриональных клеток. Было выявлено, что ФИЛ и РНК продуцируются бластоцистой (Murray R., 1990), а также в желточном мешке эмбрионов.

Прямые доказательства того, что ФИЛ является фактором, абсолютно необходимым для процесса имплантации у мышей, были получены в экспериментах с использованием генной инженерии. Было обнаружено, что у самок мышей с инактивированным ФИЛ-геном процесс фертилизации яйцеклеток не нарушен, однако последние оказались не способны к имплантации (Stewart C.L., 1992). При пересадке бластоцист от указанных самок в матку интактным самкам имплантация происходила нормально, свидетельствуя о значении ФИЛ материнского происхождения для успешного внедрения эмбриона в матку. Искусственное введение мышам с дефицитом ФИЛ-гена рекомбинантного цитокина восстанавливало процесс имплантации.

ФИЛ присутствует практически во всех клеточных структурах и тканях репродуктивной системы человека, включая яичники, маточные трубы, матку, плаценту. Функцию цитокина можно проследить на самых различных этапах репродуктивных процессов, начиная с роста и развития гамет и заканчивая наступлением и прогрессированием беременности.

Клетки мозгового и коркового слоев яичника продуцируют ФИЛ и РНК (Arici A., 1997), подтверждая вероятную роль этого цитокина в развитии яйцеклетки и физиологии овуляции. Действительно, присутствие ФИЛ было выявлено в фолликулярной жидкости человека (Arici A., 1997), где его уровень значительно повышался к моменту предполагаемой овуляции. В маточных трубах высокий уровень ФИЛ определялся в ампулярном отделе, предполагая роль ФИЛ на самой ранней стадии эмбрионального развития. Данные о роли ФИЛ в эмбриогенезе человека противоречивы. Так, результаты исследований I. Sargent и соавт. (Sargent I.L., 1998) показали, что ФИЛ in vitro способен усилить частоту образования бластоцист эмбриона человека с 18,4 % в контроле до 43,6 %. Тем не менее эти данные не были подтверждены другими исследователями (Jurisicova A., 1995).

Наиболее интригующими оказались результаты исследования функции ФИЛ в эндометрии человека, где этот цитокин продуцируется в течение всего менструального цикла (Амбарцумян Э.М., 2004).

Было выявлено, что уровень ФИЛ низкий в пролиферативную фазу, повышается после овуляции и остается относительно высоким почти до конца менструального цикла, снижаясь с началом менструации до базального уровня. Эти данные явились первыми указаниями на вероятную роль цитокина в имплантации у человека.

При иммуногистохимическом окрашивании выявлено, что ФИЛ вырабатывается в железистом и поверхностном эпителии эндометрия, а также, но в меньшей степени, в строме (Амбарцумян Э.М., 2004). В то же время экспрессия ФИЛ-специфических рецепторов ограничена поверхностным и железистым эпителием. Эти данные предполагают, что протеин ФИЛ может оказывать прямое воздействие аутопаракринным механизмом на эпителий эндометрия (но не на строму) и таким образом модулировать уровень рецептивности матки. Группой исследователей изучена взаимосвязь между экспрессией ФИЛ, его рецепторов и таким морфологическим маркером восприимчивости матки к имплантации бластоцисты, как эндометриальные пиноподии (Aghajanova L., 2003).

Результаты этих исследований показали, что в эндометрии в стадии секреции у здоровых женщин репродуктивного возраста максимальное иммуноокрашивание препаратов при использовании антител к ФИЛ и ФИЛ-рецептору совпадает по времени с развитием пиноподий. Эти данные свидетельствуют о строгой прямой корреляции между основными эндометриальными маркерами имплантации, подтверждая тем самым роль цитокина в имплантации у человека. Важно отметить, что в этот период сам эмбрион человека играет активную роль, продуцируя на своей поверхности ФИЛ-специфические рецепторы (Амбарцумян Э., 1999). Процесс взаимодействия эмбриона с материнским организмом имеет двусторонний характер: эмбрион способен активно продуцировать ФИЛ и РНК, в то время как в эндометрии уровень ФИЛ-рецепторов gp130 и функциональная активность ФИЛ-рецепторов также возрастают. Установлено, что как только эмбрион погружается в эпителий и доходит до стромы, он начинает синтезировать ряд цитокинов, IL-1; TNF и TGF-бета, индуцируя тем самым дальнейшую секрецию ФИЛ стромальными клетками. Активация рецепторов IL-1 и TNF соответствующими цитокинами приводит к фосфорилированию транскрипционного фактора Nuclear factor B (NF B) с последующей его транслокацией в клеточное ядро. В клеточном ядре указанный фактор связывается с соответствующим регионом ФИЛ-гена, индуцируя таким образом его синтез в эндометрии.

В сложных взаимоотношениях между эмбрионом и материнским организмом ФИЛ играет важную роль как медиатора, так и стимулятора. ФИЛ, вырабатываемый в децидуальной ткани, способен регулировать функцию трофобласта и способствовать его инвазии в маточную ткань. Децидуальная ткань способна вырабатывать ФИЛ, хотя и в меньшей степени, чем секреторный эндометрий. Продукция цитокина в децидуальной ткани находится под гормональным контролем материнского организма (Zaidi J. et al., 1995). ФИЛ децидуального происхождения способен модулировать уровень хорионического гормона, стимулируя или угнетая его продукцию в трофобласте в зависимости от продолжительности, дозы или времени его воздействия (Ren S.G., 1997).

Один из специфических механизмов регуляции функции фетотрофобласта цитокином может быть связан с его действием на оксид азота. Оксид азота является мощным миорелаксантом и вазодилататором, а также играет роль барьера по отношению к инфекционным агентам.

Одним из наиболее интересных аспектов ФИЛ можно считать его возможное участие в процессах трансформации трофобласта в различные его формы: в инвазивный цитотрофобласт или высокодифференцированный синцитиотрофобласт. Ряд исследований продемонстрировал, что ФИЛ способен индуцировать продукцию протеиназ клетками трофобласта (Harvey M.B., 1995), принимая таким образом участие в регуляции инвазии трофобласта. ФИЛ также стимулирует выработку в трофобласте фибронектина (Nachtigall M.J., 1996), специфического гликопротеина, ответственного за связывание трофобласта с экстрацеллюлярным матриксом эндометрия, таким образом, направляя развитие части трофобластических клеток в сторону адгезивного фенотипа. ФИЛ также способен активировать в человеческой плаценте фосфопротеин, стимулирующий вазодилатацию, который играет особую роль в миграции клеток (Kayisll U.A., 2002).

Роль ФИЛ в бесплодии человека

В числе первых клинических работ, посвященных роли ФИЛ в женской репродукции, были работы G. Delage и соавт. (1995) и S. Laird (2000). Эти исследователи показали присутствие ФИЛ в эндометрии человека, а также в промывных водах матки в период ожидаемой имплантации, причем количество цитокина было достоверно снижено у женщин, страдающих бесплодием. В дальнейшем более детальная попытка изучения роли ФИЛ в процессах имплантации у человека была проведена Амбарцумян и соавт. (2002). Авторы исследовали продукцию ФИЛ в эндометрии женщин, страдающих бесплодием неясного генеза, у которых имелась специфическая проблема нарушения имплантации. Она предполагалась у здоровых по всем остальным параметрам женщин, у которых в анамнезе имелось 5 и более безуспешных попыток экстракорпорального оплодотворения с общим количеством перенесенных эмбрионов более 10. В указанной популяции женщин в 73 % случаев наблюдается дисфункция продукции эндометриального ФИЛ. Так, секреция протеина ФИЛ у таких женщин характеризовалась высоким уровнем по сравнению с контрольным и выраженной вариабельностью в пролиферативную фазу цикла. В то же время в секреторную фазу цикла продукция цитокина характеризовалась отсутствием динамического возрастания. В результате в дни предполагаемой имплантации уровень продукции ФИЛ у бесплодных женщин с нарушением имплантации был в 3,5 раза ниже, чем у фертильных. Интересно, что в этой популяции женщин в период имплантации также значительно снижена эндометриальная секреция рецептора gp130 (Shervin J.R., 2002). Аналогично продукция эндометриального ФИЛ нарушена у женщин, страдающих многократными выкидышами (Attar E., 1998). Теоретически предполагается, что высокая концентрация ФИЛ вокруг поверхностного и железистого эпителия инициирует имплантацию (Cheng J.G., 2001). Эксперименты на животных показали, что маточная рецептивность в момент имплантации характеризуется повышенной секрецией ФИЛ в железистом эпителии и последующим связыванием его с ФИЛ-рецепторами в поверхностном эпителии (Cheng J.G., 2001).

Этот процесс имеет как прямое следствие фосфорилизацию и нуклеарную транслокацию таких транскрипционных факторов, как STAT3 (signal transducer and activator of тranscription). In vitro эксперименты показали, что локализация активированного ФИЛ STAT3 в поверхностном эпителии по времени совпадает с максимальной рецептивностью матки (Cheng J.G., 2001). Эти работы позволили прояснить некоторые механизмы функции ФИЛ как медиатора имплантации. Однако данных, свидетельствующих о механизмах действия ФИЛ в процессах имплантации человека, явно недостаточно. Одно исследование недавно было посвящено изучению генетического статуса женщин, страдающих бесплодием. В популяции этих женщин были описаны частичные мутации гена, кодирующего ФИЛ, что указывало, таким образом, на генетический аспект проблемы бесплодия и связанных с ним нарушений продукции эндометриального ФИЛ (Судома И.А. и др., 2004).

Результаты приведенных выше исследований о сниженной продукции эндометриального ФИЛ у женщин с бесплодием неясного генеза позволяют предположить возможность применения цитокина с лечебной целью в качестве заместительной терапии (Lass A., 2001). В этом плане перспективными представляются исследования, посвященные возможности локального применения цитокина. Так, результаты оригинальных экспериментов Y. Hsieh и соавт. показали (Hsieh Y.Y., 2002), что при использовании плазмидов — носителей гена ФИЛ этот цитокин может быть успешно транспортирован через липосомы в структуру эндометрия мышей, который в дальнейшем приобретает способность продуцировать ФИЛ. Было высказано предположение об аналогичной возможности in vivo транспортировки гена ФИЛ в эндометрий человека как о методе вероятной заместительной терапии. Кроме того, введение микродоз хорионического гонадотропина в полость матки в предымплантационный период стимулирует продукцию цитокина (Licht P., 2001). Как показали результаты исследований (Амбарцу-
мян Э., 1997), имеется выраженная отрицательная корреляция между концентрацией ФИЛ в эндометрии в фазе пролиферации с развитием и эхоскопической характеристикой его ткани. Эти данные свидетельствуют о роли цитокина в физиологическом развитии эндометрия. Обнаружено также, что уровень ФИЛ значительно выше в секреторную фазу цикла, чем в пролиферативную (Arici A., 1997). С другой стороны, человеческие эмбрионы преимплантационной стадии (бластоцисты) имеют на своей поверхности специфические ФИЛ-рецепторы, что свидетельствует о возможном механизме взаимодействия эмбриона и материнских тканей. Обнаружено, что у женщин с бесплодием уровень ФИЛ снижен (Chen D.B., 1995), что еще раз указывает на возможную важную роль цитокина в процессе имплантации у человека.

Ряд исследований посвящен изучению диагностических возможностей определения уровня ФИЛ. Так, в работе N. Ledee-Bataille (2002) показано, что определение уровня ФИЛ в эндометриальных смывах женщин может иметь прогностическое значение для наступления последующей беременности. У женщин, у которых на 26-й день менструального цикла выявлена дисфункция в продукции цитокина, последующий цикл ЭКО оказывался безуспешным. Интересно отметить, что в других работах, проведенных той же группой исследователей (Olivennes F., 2002), уровень ФИЛ в маточных смывах в день забора яйцеклетки не отражался на исходе процедуры ЭКО. Э.М. Амбарцумян и соавт. доказали, что уровень ФИЛ в цервикальной слизи также строго коррелирует с ростом и рецептивностью эндометрия, свидетельствуя о том, что определение уровня ФИЛ в цервикальной слизи может служить новым неинвазивным тестом для диагностики готовности матки к последующей беременности. В целом работы в этом направлении еще только начинаются и дальнейшие исследования представляют значительный интерес.

Таким образом, анализ современной литературы свидетельствует о неоспоримой роли ФИЛ в репродукции человека. ФИЛ активно синтезируется органами репродукции человека и принимает важное участие в физиологических изменениях эндометрия. Ряд прямых и косвенных данных свидетельствуют о специфической функции цитокина в процессах имплантации, а именно в создании благоприятного микроклимата в репродуктивных органах, и его посреднической роли между эмбрионом и материнским организмом. ФИЛ также принимает активное участие в функции плаценты, регулируя процессы роста, дифференцировки и функциональной активности трофобласта.

Дальнейшее изучение механизма действия этого цитокина будет способствовать лучшему пониманию патофизиологических процессов, регулирующих репродуктивную функцию человека, гарантируя новые лечебные и диагностические подходы.

Следующей группой молекул, играющих важную роль в непосредственном процессе имплантации, являются интегрины, а также гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста. Интегрины принадлежат к семейству клеточных адгезивных молекул, которые присутствуют практически во всех клетках и принимают участие в клеточно-клеточных и клеточно-матричных реакциях распознавания (Sharpe-Timms K.L., 2001). Интегрины — это гликопротеиды клеточной поверхности, которые состоят из двух субъединиц α и β. Эти субъединицы используются как рецепторы для экстрацеллюлярного матрикса. Большое количество интегринов постоянно экспрессируется в эндометрии на протяжении менструального цикла. В эпителиальных клетках α2β1, α3β1, α6β4 присутствуют во всех фазах цикла (Lessey B.A., 2000).

В поверхностном эпителии α6β4 увеличиваются во время имплантации, а в железах резко уменьшаются (Lantery E., 1998).

В стромальных клетках классический рецептор фибронектина α5β 1290 экспрессируется постоянно, а в эпителиальных в норме не выявляется (Lessey B.A., 2000).

Важную роль в процессе роста и дифференцировки эндометрия и взаимодействия эндометрия и бластоцисты играет апоптоз (Tilly J.L., 2002).

Апоптоз — это универсальный физиологический процесс, который отвечает за поддержание гомеостаза в многоклеточных организмах. Термин «апоптоз» (от греческого apo и ptosis — убежать от чего-либо) впервые предложен J. Kerr, A. Wyllie, A. Currie в 1972 году для описания физиологической смерти клетки. В работе J.F.R. Kerr и соавт. описаны основные этапы апоптоза:

— отделение клеток от других и/или от экстрацеллюлярного матрикса;

— потеря цитоплазматического объема;

— конденсация хроматина и краевое расположение вдоль ядерного конверта;

— фрагментация цитоплазмы клетки в связанные с мембраной везикулы, которые называются апоптотическими тельцами.

Конечная судьба этих клеток — фагоцитоз клеточных фрагментов макрофагами или окружающими эпителиальными клетками. Апоптотическая клетка представляет также некоторые биохимические изменения. Наиболее известные из них — фрагментация ядерного хроматина в моно- и олигонуклеосомальные единицы (180–200 bp). Во время апоптоза происходит смерть клетки без выделения ею протеолитических ферментов и других клеточных составных частей, уменьшая вероятность возникновения воспалительного процесса. В регуляции менструального цикла функция апоптоза состоит в элиминации функционального слоя эндометрия во время поздней лютеиновой и менструальной фаз. Это сопровождается пролиферацией новых клеток из базального слоя во время пролиферативной фазы последующего менструального цикла. По данным некоторых авторов (Koka-wa K., 2001), апоптотические клетки распределены приблизительно одинаково в железах и в строме. Другие исследователи (Dahmoun M., 1999) полагают, что большинство апоптотических клеток эпителиального происхождения и значительное меньшинство — стромального. Возможно, апоптоз является динамическим процессом, который начинается в базальных железах и распространяется через функциональный слой в строму (Von Rango H., 1998).

В 2000 году T.E. Vaskivuo и соавт. исследовали связь апоптоза с гормональной регуляцией (Vaskivuo T.E., 2000).

В процессе исследования оказалось, что эндометриальный апоптоз негативно коррелирует с концентрацией эстрадиола в сыворотке крови, а самое достоверное увеличение интенсивности апоптоза наблюдается при падении концентрации эстрадиола и прогестерона в поздней лютеиновой фазе. Падение концентраций этих гормонов вызывает вазоконстрикцию спиральных артериол, что также приводит к ишемии и некрозу эндометрия. Таким образом, в процессе отторжения эндометрия задействованы оба механизма — некроз и апоптоз, интенсивность которого остается высокой в фазе десквамации. Вероятнее всего, главная функция апоптоза в эндометрии, пик которого наступает в ранней стадии пролиферации, состоит в завершении процесса элиминации остатков эндометрия, в «дообработке» старых клеток. У пациенток с гинекологической патологией эти функции нарушены (Dmow ski W.P., 2001). Основываясь на этих исследованиях, можно считать, что снижение и разурегулированность апоптоза в эндометрии больных с эндометриозом и аденомиозом, может быть, является одним из главных механизмов возникновения и прогрессирования самого заболевания, а также причиной диспластических и гиперпластических процессов эндометрия.

Эмбрион является активным участником процесса имплантации. Наличие бластоцисты в стадии позиционирования предохраняет эндометрий от апо-птоза. В работе A. Galan (2000) показано, что даже эмбрионы, не достигшие стадии бластоцисты, снижают количество апоптотических клеток в культуре эндометриальных эпителиальных клеток. Однако далее, на стадии адгезии, бластоциста индуцирует паракринную апоптотическую реакцию. Вероятнее всего, система запуска апоптоза Fas/Fas-L задействована в преодолении барьера для имплантации бластоцисты (Galan A., 2000).

Наряду с вышеизложенными механизмами в имплантации эмбриона задействованы иммунологические процессы. В 1953 году Питер Брайн Медавар впервые выдвинул гипотезу, согласно которой плод рассматривается как наполовину чужеродный аллогенный трансплантат. В последующем были проведены многочисленные научные исследования в области иммунологии репродукции, однако удалось выяснить лишь некоторые механизмы иммунологической толерантности материнского организма к плоду.

Механизмами, обеспечивающими процесс выживания эмбриона и плода, являются:

— селективная экспрессия антигенов, являющихся критическими по аллореактивности;

— наличие некоторых цитокинов в маточно-плодовом пространстве;

— локальная продукция специфических иммуносупрессивных агентов (Шмагель К.В., 2003).

Взаимодействие между матерью и эмбрионом развивается в двух несколько различных направлениях. С одной стороны, фетоплацентарные ткани нуждаются в надежной антиинфекционной защите, с другой стороны — необходима толерантность к плацентарным аллоантигенам. На стадии имплантации и ранних стадиях эмбриогенеза толерантность обеспечивается преимущественно неспецифическими механизмами, такими как гормональная иммуносупрессия (хорионический гонадотропин, прогестерон), некоторыми специфическими антигенными свойствами трофобласта (Vassiliaou N., 1999).

Одним из первых изменений в периферическом иммунном ответе является увеличение количества лейкоцитов (Nieuwenhoven A.L., 2003).

Наиболее изученным являются изменения в состоянии Т-лимфоцитов. В популяции Т-лимфоцитов выделяют Т-хелперы (Тх) и Т-цитотоксины/супрессоры (Тс). Тх помогают другим иммунным клеткам, продуцируя цитокины, а Тс могут непосредственно элиминировать чужеродные и инфицированные клетки. Количество Тх и Тс может либо изменяться, либо не изменяться на протяжении беременности. Тх по типу цитокинов, которые они продуцируют, разделяют на 2 типа: первый (Тх-1) и второй (Тх-2). Тх-1 — провоспалительные цитокины продуцируют гамма-интерферон, IL-2, фактор некроза опухоли, которые стимулируют клеточные реакции. Тх-2 — противовоспалительные цитокины продуцируют IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13, которые принимают участие в гуморальном иммунном ответе.

В 1993 году T.G. Wegmann и соавт. впервые предложили концепцию беременности как Тх-2 феномена (Weg-mann T.G., 1993). Переключение продукции цитокинов с типа Тх-1 на Тх-2 происходит под влиянием прогестерона через индукцию прогестерониндуцированного блокирующего фактора в лимфоцитах (Check J.H., 1997).

Другим механизмом влияния может быть «вмешательство» трофобласта в продукцию цитокинов. Так, было показано, что in vitro плацентарные и трофобластические клетки продуцируют факторы, тормозящие цитотоксическую активность Т-лимфоцитов (Agarwal R., 2000). Более того, трофобластические клетки продуцируют цитокины преимущественно 2-го типа, что также определяет материнский ответ.

Таким образом, успешность беременности поддерживается в основном типом реакции Тх-2 (Chaouat G., 1999). Цитокины 1-го типа могут прямо или опосредованно разрушать эмбрион путем активации цитотоксичности. Так, TNF-α может вызвать некроз имплантированного эмбриона, гамма-интерферон ингибирует секрецию CSF-1, который способствует росту и дифференцировке бластоцисты. Среди цитокинов типа Тх-2, наверное, наиболее важным является IL-10. Этот цитокин продуцируется в большом количестве в децидуальном слое на материнско-фетальной границе. Инъекции IL-10 клону мышей, склонных к самопроизвольным абортам, обеспечивали сохранение беременности, и, наоборот, введение им анти-IL-10-антител увеличивало количество самопроизвольных абортов (Griesinger G., 2000).

Несмотря на большое значение натуральных киллеров в механизмах сохранения беременности, в литературе опубликовано очень мало данных относительно периферических NK у беременных (Nieuwenhoven A.L., 2002). Количество NK, а также продукция ими гамма-интерферона значительно уменьшается у беременных в сравнении с небеременными. Эти изменения количества и активности NK также связаны с переключением от клеточного к гуморальному типу иммунного ответа.

У беременных NK являются эмбриотоксическими. Так, A. Beer и соавт. (1996) показали, что если у женщин, проходящих лечение методом ЭКО, процентное соотношение превышало 18 %, рождение живых детей не наблюдалось. Более того, у пациенток с самопроизвольными абортами Т-лимфоциты и NK-клетки проявляли эмбриотоксичность in vitro (Bulmer J.N., 1991).

Во время инвазии эмбриона трофобласт тесно контактирует с различными материнскими клетками, такими как железистые, стромальные, эндотелиальные клетки, и особенно материнские лейкоциты. Лейкоциты составляют около 10 % клеток стромы в фазе пролиферации, 20 % — в середине секреторной фазы (предымплантационный период) и возрастают до 30 % при наступлении беременности (Bulmer J.N., 1991).

Популяция лейкоцитов состоит из Т-клеток, макрофагов и больших гранулезных лейкоцитов — LGL (large granulated lymphocytes). Часть Т-клеток составляет 45 % в фазе пролиферации и уменьшается в секреторной фазе, абсолютное их количество остается неизменным на протяжении менструального цикла (Bulmer J.N., 1996). Количество макрофагов также остается постоянным, увеличиваясь только в стадии десквамации.

LGL, или эндометриальные NK, функционально и фенотипически принадлежат к естественным киллерам, но в отличие от NK периферической крови они экспрессируют CD56, но не экспрессируют CD16 и CD57. Они редко встречаются в эндометрии в фазу пролиферации, однако в лютеиновую фазу и в фазу ранней гестации их количество быстро возрастает и составляет более 80 % всех лейкоцитов (Судома И.А., 2004).

NK образуются в костном мозге. После дифференцировки они попадают в периферическую циркуляцию на очень ранней стадии созревания. Их физиологическая роль заключается в контроле интенсивности инвазии трофобласта и предупреждении возникновения локальной инфекции. Материнские Т-клетки теоретически не могут ни распознать, ни уничтожить фетальные клетки, которые не имеют антигенов классических молекул МНС (major histocompatibility complex — главного комплекса гистосовместимости) класса 1 и 2. Децидуальные Т-клетки также не могут in vitro разрушить клетки трофобласта первого триместра, но если на протяжении короткого времени их выдержать с IL-2, они активируются и могут специфически распознавать и убивать клетки, которые не имеют или имеют недостаточное количество антигенов класса МНС (King A., 1999). Возникает вопрос, каким образом фетальные клетки избегают разрушения LGL in vivo, ведь в эндометрии определяется большое количество IL-2. Пять независимых групп экспертов пришли к выводу, что защиту от цитолиза, обусловленного LGL, выполняют молекулы HLA-G и HLA-1b (Сківка Л.М., 2004). Были обнаружены рецепторы на LGL, которые могут посылать тормозящие сигналы после взаимодействия с HLA-G и, вероятно, HLA-1b-антигенами. Однако, несмотря на наличие таких тормозящих сигналов, в работах ряда авторов было доказано, что повышенное количество периферических NK в крови и повышенная инфильтрация эндометрия NK вызывает перенапряжение и срыв механизмов блокировки, что приводит к нарушению имплантации в программах ЭКО и таким осложнениям беременности, как преэклампсия и самоаборты (Kwak J.Y., 2000). Другой важный механизм защиты эмбриона связан с тем, что во время имплантации запускаются провоспалительные процессы, местные лейкоциты активируются, под влиянием хемокинов появляется большое количество фагоцитирующих клеток. Львиную долю этих клеток составляют полиморфноядерные лейкоциты (нейтрофилы и эозинофилы), которые обладают очень коротким периодом жизни и погибают в течение 1–3 дней. Исследования на животных моделях показали, что эта фаза беременности характеризуется действием провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α, интерлейкин-1, гамма-интерферон. Через несколько дней заканчивается провоспалительная фаза беременности, под действием прогестерона и инвазии бластоцисты происходит сдвиг баланса цитокинов с Tx-1 к Tx-2-типу (Сківка Л.М., 2004).

Окно имплантации и окно переноса

Необходимо различать окно имплантации и окно переноса (Navot D., 1991).

Действительно, большинство программ ЭКО предполагают перенос эмбрионов в полость матки на стадии 4–8 клеток (2–3-й день после оплодотворения). Этот промежуток времени называется окном переноса и предшествует окну имплантации на 2–4 дня.

В настоящее время большинство репродуктологов стремится пролонгировать культивирование эмбрионов in vitro до стадии бластоцисты (Blake D., 2002; Wilson M., 2002; Racowsky C., 2002; Plachot M., 2000).

Основная цель пролонгированного культивирования — синхронизировать окно переноса и окно имплантации, убедиться in vitro, что произошла активация генома эмбриона (стадия 8 клеток) и что предымплантационное развитие эмбриона удовлетворительное. Все это должно увеличить процент имплантаций. Противники пролонгированного культивирования приводят аргументы о необходимости перенести эмбрион как можно быстрее в его физиологическую среду, так как условия in vitro не абсолютно идентичны условиям in vivo. И, кроме того, созревания эндометрия при стимуляции яичников ускорено. И, наконец, результаты пролонгированного культивирования значительно варьируют от одной команды к другой.

Описание процесса имплантации

Имплантация состоит из двух феноменов: аппозиция-адгезия, общая для всех млекопитающих, и инвазия, которую находят у rongeurs и приматов (следовательно, у человека). В этих двух группах начало имплантации имеет фиксированную точку отсчета, после «вылупливания» бластоцисты из блестящей оболочки или же после хетчинга. Адгезия трофобластического эпителия и эндометрия — настоящий биологический парадокс. На уровне места имплантации эти два эпителия разного генетического происхождения (эпителий бластоцисты с одной стороны и неадгезивная поверхность апикальной части клеток эпителия с другой стороны) сливаются. Доказано раннее влияние фетального онкофибронектина, выявляемого на наружной поверхности клеток трофобласта, и интегринов, расположенных по краю апикально-латеральных клеток эпителия матки. На участке концептуса, где происходит первый контакт между трофобластом и эпителием просвета, в дальнейшем формируются ворсины хориона с последующим формированием плаценты.

Адгезия бластоцисты к эпителию просвета

Неадгезивная природа эпителия матки обусловлена наличием слоя гликокаликса, покрывающего поверхность клеток эпителия. Гликокаликс — разновидность муцина MUC-1 — экспрессирован на поверхности клеток эпителия человека и мышей. У человека его экспрессия максимальна в период имплантации, в то же время у мышей она минимальна в этот момент. У женщин экспрессия MUC-1 на уровне эпителия матки прогестеронозависима и возрастает к концу фазы пролиферации, чтобы стать максимальной во время окна имплантации (Hey N.A., 1994).

В последних работах с использованием клеточной культуры in vitro при культивировании клеток эпителия и человеческого эмбриона доказано, что во время фазы аппозиции наличие эмбриона увеличивает экспрессию MUC-1 на уровне клеток эпителия. Но после адгезии бластоцисты к клеткам эпителия наступает паракринное ингибирование синтеза MUC-1 в месте имплантации. Можно сделать вывод, что MUC-1 — антиадгезивная молекула, которая, вероятнее всего, локально при наличии бластоцисты становится участником фазы адгезии (Meseguer M., 2001).

Инвазия трофобласта

В зависимости от степени проникновения трофобласта в эндометрий различают гистологический тип плаценты. У человека и позвоночных эта пенетрация максимальна с эрозированием сосудистого эндотелия. Следовательно, речь идет о гемохориальном типе плацентации. У приматов инвазия происходит путем интрузии: синцитиотрофобласт проникает между клетками эпителия матки, прежде чем их фагоцитировать. Связывание клеток трофобласта с составляющими базальной мембраны и внеклеточного матрикса осуществляется посредством интегринов. Распространение трофобласта в строму матки сопровождается лизисом базальной мембраны путем активации протеаз и металлопротеаз. Этот процесс строго контролируется и ограничивается местом имплантации (в отличие от опухолевого процесса) благодаря равновесию между секрецией металлопротеаз и их специфических ингибиторов — тканевых ингибиторов металлопротеаз под влиянием цитокинов и факторов роста (фактор некроза опухоли, ФИЛ, эпидермальный фактор роста).

Перенос эмбрионов

Наряду с проблемами рецептивности эндометрия техника переноса при хорошем качестве эмбрионов, как нам кажется, является определяющим моментом. Лучше выполнять его под контролем УЗИ, чтобы избежать травматизации эндометрия и кровянистых выделений. Сокращения матки и дискомфорт после переноса также являются векторами неудачной имплантации.

Хорошим прогностическим резервом, при условии что все остальные факторы фертильности в норме, является пролонгирование культивирования эмбрионов. И здесь необходимо отметить, что блокирование развития эмбрионов на 3-й или 4-й день культивирования во время активации генома эмбриона чаще всего зависит от особенностей спермы, а не яйцеклетки, особенно если на 3-й день эмбрион правильной формы и не фрагментирован. В заключение необходимо напомнить, что правильно собранный анамнез, адекватное обследование помогают принять правильное терапевтическое решение. Этот этап также помогает нам достичь максимальной эффективности лечения, при условии что эмбриологи также будут проводить селекцию эмбрионов. В случае неудачных попыток необходимо производить повторный анализ истории супружеской пары с учетом выявленных возможных причин неудач. Многие ли клиницисты и эмбриологи выполняют это? В то же время большинство пар с неудачными попытками ЭКО нуждаются в более индивидуализированном, адаптированном лечении. А правильно изложенная информация позволяет супружеским парам раньше обратиться к другим программам (донация яйцеклеток и эмбрионов, адаптация).

Заключение

Рецептивность матки зависит от влияния многих факторов, которые в дальнейшем участвуют в процессе имплантации. С первых моментов зарождения новой жизни начинается материнско-плодовый диалог, для понимания которого необходимо интегрировать множество механизмов. Расшифровка этого диалога, развитие диагностических возможностей, индивидуальная подготовка женщины к имплантации эмбриона представляет собой огромный резерв для будущего репродуктивной медицины.


Similar articles

Роль эмбрионального фактора в эффективности первого цикла IVF
Authors: Гюльмамедова И.Д. - Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького; Институт репродуктивной медицины, г. Киев
"Medical and social problems of family" 3 (том 18) 2013
Date: 2013.11.08
Categories: Obstetrics and gynecology
Sections: Clinical researches
Современные подходы к стратегии переноса эмбрионов в программе ВРТ
Authors: И.Д. Гюльмамедова, И.Е. Ильин, О.С.Доценко, А.В. Чайка, Т.И. Слюсарь, Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького
"Medical and social problems of family" 1 (том 17) 2012
Date: 2012.04.16
Categories: Obstetrics and gynecology
Sections: Clinical researches
Антимюллеров гормон   как прогностический маркер контролированной овариальной стимуляции   у женщин с низким овариальным резервом
Authors: Гюльмамедова Е.А., Трофимова Е.А., Гюльмамедова И.Д., Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького, Донецкий региональный центр охраны материнства и детства
"Medical and social problems of family" 1 (том 18) 2013
Date: 2013.04.15
Categories: Obstetrics and gynecology, Endocrinology
Sections: Clinical researches

Back to issue