Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.

"News of medicine and pharmacy" Аллергология (280) 2009 (тематический номер)

Back to issue

Іммобілізація алергенів для створення потенційних діагностичних і лікарських засобів інтраназального способу введення

Authors: І.І. Романовська, к.х.н., С.М. Пухлик, д.м.н., Б.М. Пухлик, д.м.н. Фізико-хімічний інститут ім. О.В. Богатського НАН України Одеський державний медичний університет

print version

Постійне зростання кількості алергічних захворювань, у тому числі алергічних ринітів (АР) і медикаментозної алергії, частота яких коливається, за даними ВООЗ, у межах 40 %, а діагностика і специфічна імунотерапія (СІТ) проводиться інвазійними способами, незручними, часто небезпечними для хворих, викликає необхідність розробки їх пролонгованих стабільних форм і нових шляхів уведення. Засобом створення таких може бути іммобілізація алергенів і лікарських засобів (ЛЗ) з використанням полімерів медичного призначення для інтраназального введення.
Дані літератури щодо інтраназальних методів уведення алергенів є нечисленними: відоме проведення діагностики непереносимості аспірину розчином лізин-аспірину [1], СІТ алергічних ринітів — паперовими дисками, імпрегнованими розчинами алергенів [2], ліпосомними формами алергенів, алергоїдами [3, 4], рекомбінантними алергенами [5]. Однак у деяких випадках не досягнуто суттєвої стабілізації препаратів, пролонгованості алергену, виникали труднощі в точності його дозування, до того ж нові форми алергенів є складними і надто дорогими.
Метою даного дослідження було створення іммобілізованих форм алергенів інтраназального шляху введення як потенційних засобів для лікування, діагностики алергічних ринітів і лікарської непереносимості новокаїну й аспірину (АСП), діагностики функціонального стану слизової оболонки носової порожнини.

Матеріали та методи дослідження
У роботі використовували комерційні препарати харчових (алерген білка курячого яйця — АБКЯ), побутових (алерген хатнього пилу — АХП) і пилкових алергенів (алерген пилку берези — АПБ), стандартизовані в од. PNU (білковий азот), стабілізовані 0,4% розчином фенолу, новокаїн, метиленовий синій (МС), ацелізин-КМП (суміш DL-лізину ацетилсаліцилату та гліцину).
Як матриці для включення препаратів використовували гідрофільні полімери — полівініловий спирт (ПВС) (Мол. м. 30 000), поліетиленоксид-400 (ПЕО-400), поліетиленгліколі (ПЕГ) з Мол. м. 13 000–15 000 і 40 000, желатин, желатин у комбінації з полівінілпіролідоном (ПВП) (Мол. м. 2 000 000), а також гліцерин як пластифікатор і стабілізатор.
Полімерні плівки виготовляли за розробленою методикою: відповідні розраховані дози алергенів та ЛЗ змішували з розчинами полімерів і додавали гліцерин як пластифікатор.
Суміші розливали на підложки, висушували в ексикаторі над СаСl2, висікали однорідні, еластичні, непересихаючі плівки діаметром 0,5 см, запаювали їх у поліетиленові пакети і зберігали при температурі 4 °С у сухому, захищеному від світла місці.
Кількісне визначення вмісту білка [6], фенолу [7], новокаїну, метиленового синього [8], аспірину в комерційних та іммобілізованих препаратах алергенів та ЛЗ проводили спектрофотометрично (СФ-46), для чого будували калібрувальні залежності.
Біофармацевтичну оцінку діагностичних плівок (ДП) із ЛЗ здійснювали в експерименті in vitro методом діалізу крізь гідратцелюлозну напівпроникаючу мембрану «Діацелл» (розмір пор 0,4 мкм) відносно дистильованої
води при температурі 37 оС із кількісним визначенням препаратів у діалізаті.
Дані експерименту піддавали математичній обробці за програмами статистичної залежності, які включають обчислення значень середнього арифметичного, середнього квадратичного відхилення, стандартної середньої похибки експерименту та критерія Стьюдента [9], а також, у випадку непараметричних показників, виконували обчислення за критеріями Уайта і Фішера [10].
Перевірка збереження вмісту ЛЗ у плівках проводилась методом тонкошарової хроматографії.

 

Результати дослідження
та їх обговорення

Використовуючи дані, наведені в літературі, та результати власних досліджень про стабілізуючу дію розчинів полімерів стосовно ферментів (протеаза, стерилаза) [11], здійснили включення АБКЯ (1000 PNU) в 10% розчини гідрофільних полімерів медичного призначення (ПВС, ПЕГ, ПЕО), відзначивши високий рівень збереження вмісту білка і фенолу (81,7–100,0 %); через 3 місяці зберігання вміст фенолу не змінився, а вміст білка зменшився на 10–20 % [12].
Оскільки полімерні плівки є зручними для дозованого введення препарату, пролонговують його дію, здійснили включення АПБ, АБКЯ й АХП у плівки на основі ПВС.
Дані, наведені в табл. 1, демонструють утворення стабільних плівкових форм алергенів (АХП і АБКЯ) у зростаючих дозах. Для діагностики АР отримали полімерні плівки (ДП) з алергенами у дозі 200 PNU, час виходу з плівки — 30 хв.
Для підсилення пролонговування використовували обробку носія (ПВС) тетраборатом натрію, при цьому вихід алергену з плівки залежить від концентрації бури (рис. 1, 2). Утворення комплексу білка з носієм і бурою доведене дослідженням кінематичної в’язкості розчинів і підтверджене методом УФ-спектроскопії на модельних алергенах — овальбуміні та лізоцимі.
Іммобілізацію метиленового синього, новокаїну, ацелізину здійснювали включенням в полімерні плівки на основі ПВС, желатину, желатину в комбінації з ПВП, визначали колір, площу, середню масу, розчинність.
Розроблені нами полімерні плівки (матриця — ПВС) для оцінки транспортної функції слизової оболонки носу з метиленовим синім і сахаринатом натрію мали довгий строк зберігання (2,5 року), високу доступність, економічність [8].
Для діагностики алергії до новокаїну і непереносимості аспірину розроблені плівки з кількісним умістом новокаїну (10, 50 і 100 мкг) [8] і аспірину (0,5; 1,5; 3,0 мг), що є стабільними при зберіганні, мають високу доступність (табл. 2, 3), причому встановлено пролонговування досліджених ЛЗ при використанні желатину як матриці.
На основі плівкових форм алергенів був запропонований метод інтраназальної СІТ алергічних ринітів [13]: плівка з мінімальною дозою алергену вводиться у порожнину носа на носову перегородку на відстані 1,5–2 см від входу у ніс; у міру її розчинення (25–30 хв) відбувається поступовий вихід алергену з наступним всмоктуванням крізь слизову оболонку носа. Подальше введення плівок із зростаючою концентрацією алергену проводиться за традиційною схемою СІТ. Інтраназальну СІТ розпочато у 2002 р. у 28 хворих-добровольців (віком 18–55 років) із цілорічним алергічним ринітом (ЦАР) з виявленою гіперчутливістю до хатнього пилу. У 20 пацієнтів натепер спостерігаються стабілізація алергічного процесу та підвищення якості життя, підтверджені ЛОР-оглядом, імунологічними дослідженнями, риноманометрією; причому побічної дії плівок не виявлено. Інтраназальна СІТ полімерними плівками з пилковими алергенами проводилася 40 хворим на цілорічний алергічний риніт пилкової етіології у НДІ оториноларингології ім. О.С. Ко-ломийченка (м. Київ) під керівниц­твом академіка Д.І. Заболотного: у 29 пацієнтів повністю зникли симптоми АР, у 8 хворих зменшилась їх вираженість.
Інтраназальна провокаційна проба ДП з АХП на 28 добровольцях, хворих на ЦАР, показала зростання симптоматики АР (свербіж у носі, чхання, сльозотеча, закладення носу, ринорея) відповідно до виходу алергену з плівки (рис. 3). Її результати у 25 осіб були підтверджені внутрішньошкірною пробою; показано вірогідність і відносну безпечність запропонованого методу [14]. Желатинові плівки з новокаїном для діагностики алергії до новокаїну використовували на 10 хворих-добровольцях із виявленою сенсибілізацією до новокаїну. Через 15–20 хв після введення плівок у носову порожнину спостерігали чітку симптоматику алергічної реакції. При концентрації новокаїну 50 мкг у плівці досягається високий діагностичний результат і мінімум ускладнень.
За допомогою ДП із концентрацією аспірину 3 мг (матриця ПВС) уперше розроблений інтраназальний провокаційний тест для діагностики непереносимості аспірину. На рис. 3 наведені відмінності клінічних показників: місцевих симптомів і стану носового дихання у хворих 1-ї і 2-ї груп: з аспіриновою бронхіальною астмою і нечутливих до аспірину.
У 28 добровольців, хворих на ЦАР, досліджувалася транспортна функція миготливого епітелію слизової оболонки носа з ДП із МС (матриця ПВС). При цьому фіксували час виходу МС з плівки (7–8 хв), подальший його рух по слизовій оболонці носу і потоки слизу в глотці. У 20 пацієнтів із порушеною функцією слизового епітелію час транспорту МС становив 20–30 хв, у здорових осіб — 15–20 хв. Отже, запропонований спосіб діагностики транспортної функції епітелію слизової оболонки носа дозволяє вірогідно оцінити її в нормі та при патології.

Висновки
1. Методи іммобілізації, що наведені, дозволяють створювати стабільні пролонговані форми алергенів і розробляти інтраназальний шлях їх уведення.
2. За допомогою полімерних плівок із включеними алергенами створений метод інтраназальної СІТ алергічних ринітів.
3. Плівкові форми алергенів дозволяють діагностувати алергічні риніти, лікарську непереносимість, стан слизової оболонки носової порожнини.


Bibliography

1. Tomaz E.M., Ferreira M.F., Spinola M.A., Oliveira M.L., Clo-de M.H., Palma-Carlos A.G. Nasal provocation tests in the diagnosis of urtricaria induced by acetylsalicylic acid // Allergy and asthma proc. — 1997. — 18. — P. 319-322.
2. Клиническая иммунология и аллергология / Под ред. Г. Лолора-младшего, Г. Фишера, Д. Адельмана. — М.: Практика, 2000. — 806 с.
3. Пухлик Б.М. Элементарная аллергология. — Винница: Велес, 2002. — С. 69-73.
4. Райкис Б.Н., Казиев А.Х. Настоящее и будущее лечебных аллергенов. — М.: Триада-Х, 2001. — 247 с.
5. Winkler B., Baier B., Wagner S. et al. Mucosal tolerance as therapy of type allergy: intranasal application of recombined Bet v 1, the major birchpollen allergen, leads to the supression of allergic immune responses and airway inflammation in sensitized mice // Allergy. — 2002. — 32. — P. 30-36.
6. Якубке Х.Д. Аминокислоты, пептиды, белки. — М.: Наука, 1985. — С. 335-356.
7. Коренман И.М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений. — М.: Наука, 1983. — 358 с.
8. Романовская И.И., Давиденко Т.И., Пухлик С.М. Диагностические полимерные пленки с новокаином и метиленовым синим // Вiсник ОНУ. — 2004. — Т. 9, № 3. — С. 108-113.
9. Иванов Ю.И., Погорелюк О.Н. Статистическая обработка результатов медико-биологических исследований на микрокалькуляторах по программам. — М., 1990. — 224 с.
10. Архипова Г.П., Лаврова И.Г., Трошина И.М. Некоторые современные методы статистического анализа в медицине. — М., 1971. — 76 с.
11. Давиденко Т.И., Романовская И.И., Чуманова М.А. и др. Литическая активность иммобилизованной стерилазы (литического ферментного комплекса Streptomyces recifensis var. litycus) // Хим.-фарм. журн. — 2001. — Т. 35, № 10. — С. 14-17.
12. Романовская И.И., Давиденко Т.И. Иммобилизация аллергенов белка куриного яйца и домашней пыли // Доп. НАН України. — 2000. — № 1. — С. 160-
164.
13. Пат. 4268А Україна, МПК 7 А61В 10/00 Спосіб специфічної імунотерапії алергічних ринітів / Б.М. Пухлик, С.М. Пухлік, Т.І. Давиденко, І.І. Романовська, Д.І. Заболотний (Україна). — № 2000074259; Заявл. 17.07.2000; Опубл. 15.10.2001.
14. Пухлик С.М., Романовс­кая И.И., Давиденко Т.И. Клинико-экспериментальное исследование изготовления и применения иммобилизованных аллергенов в ринологии // Ринология. — 2002. — № 1. —
С. 42-45. 

Similar articles

Authors: І.І. Романовська, к.х.н., доцент, зав. лабораторією фізико-хімічних основ біотехнології Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України В.А. Топтіков, к.б.н., доцент кафедри генетики біологічного факультету ОНУ ім. І.І. Мечникова
"News of medicine and pharmacy" Аллергология (280) 2009 (тематический номер)
Date: 2009.07.14
Authors: І.В. Корицька Вінницький національний медичний університет ім. М.І. Пирогова
"News of medicine and pharmacy" Аллергология (280) 2009 (тематический номер)
Date: 2009.07.14
Authors: І.В. КОРИЦЬКА, Вінницький національний медичний університет
"News of medicine and pharmacy" Аллергология и пульмонология (246) 2008 (тематический номер)
Date: 2008.10.09
Categories: Allergology, Immunology
Sections: Specialist manual

Back to issue