Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.

"News of medicine and pharmacy" Аллергология (280) 2009 (тематический номер)

Back to issue

Електрофорез алергенів білка курячого яйця й хатнього пилу

Authors: І.І. Романовська, к.х.н., доцент, зав. лабораторією фізико-хімічних основ біотехнології Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України В.А. Топтіков, к.б.н., доцент кафедри генетики біологічного факультету ОНУ ім. І.І. Мечникова

print version

Вступ
Частота алергії до хатнього пилу та харчової непереносимості (за даними ВООЗ, до 25 % населення деяких індустріальних районів страждають від цього захворювання, причому найбільш поширені поліноз, цілорічний алергічний риніт, бронхіальна астма, атопічний дерматит [1, 2]), що збільшується, обумовлює необхідність вивчення складу препаратів алергенів, що виробляються для діагностики і специфічної імунотерапії. Одним із найбільш уживаних методів для встановлення білкового складу комерційних алергенів є гель-електрофорез [3].
Тому становить інтерес дослідження білкового складу вироблюваних на Україні ТОВ «Імунолог» алергенів білка курячого яйця (АБКЯ) і хатнього пилу (АХП) з використанням методу їх електрофоретичного розділення в поліакриламідному гелі.

Методи дослідження
У роботі використовували надані
Вінницьким ТОВ «Імунолог» комерційні препарати алергенів білка курячого яйця (АБКЯ, серія 706.2) і хатнього пилу (АХП, серія 006.9) у водно-сольовій формі, що стандартизовані за білковим азотом (PNU/см3), з додаванням 0,4% фенолу як консерванту. Уміст білка в алергенах визначали за методом Брадфорда [4]: до проб алергенів об’ємом 1 см3 додавали 4 см3 реактиву, збовтували і через 10 хв фотометрували при λ = 595 нм. Перед електрофоретичним розділенням препарати інкубували протягом 2 хв при температурі 100 °С у присутності 1% додецилсульфату натрію і 1% b-меркаптоетанолу [5]. Електрофорез проводили на апараті Helicon (Росія) у системі Леммлі [6] у 15% поліакриламідному гелі (ПААГ). Препарати АБКЯ і АХП аналізували в п’яти повторностях. Фіксацію й забарвлення білків після електрофоретичного розділення здійснювали в розчині складу: кумасі R-250 — 0,1 %, оцтова кислота — 10 %, ізопропанол — 25 %, формальдегід — 5 %, етанол — 25 %.
Гелі відмивали 7% оцтовою кислотою до повного знебарвлення фону.
Електрофореграми документували за допомогою сканера Hewlett Packard Scanjet 4470c з подальшим збереженням зображення в пам’яті комп’ютера. Кількісний аналіз електрофореграм проводили за допомогою комп’ютерної програми АНАІС.
 

Молекулярну масу досліджуваних білків розраховували за калібрувальною кривою «відносна електрофоретична рухливість/lg молекулярної маси в дальтонах», побудованою з використанням таких маркерних білків: цитохром С, лізоцим, міоглобін, пероксидаза, овальбумін, сироватковий альбумін бика.

Результати й обговорення
Як показали результати досліджень, в електрофоретичному спектрі білків АБКЯ можна виділити дві основні зони (табл. 1, рис. 1а).
Основна кількість матеріалу (75,3 %) зосереджена в низькомолекулярній частині спектра АБКЯ з відносною електрофоретичною рухливістю (Rf) у 15% ПААГ від 0,13 до 0,4. Дана частина спектра виглядає як масивна, розтягнута, інтенсивно забарвлена пляма. Денситометрування (рис. 2) дозволяє виділити в цій зоні 3 основні фракції: 1, 2, 3 (субфракції 3а і 3b). Білки фракції 3 (55,9 %) мають молекулярну масу 42 200 ± 4600 — 49 500 ± 5400 Да. Молекулярна маса білків фракції 2 — 34 300 ± 3800 Да (16,90 ± 0,69 % у загальному спектрі). Уміст фракції 1 (молекулярна маса — 14 300 ± 800 Да) становить 2,5 % у загальному спектрі.
У малорухливій частині спектра АБКЯ ідентифікуються п’ять смуг із значеннями Rf в 15% ПААГ 0,10; 0,07; 0,04; 0,02 і 0,01. Найбільш значна фракція білка в цій зоні — № 6. Кількісно вона становить у загальному спектрі 15,7 %. Молекулярна маса даних білків становить 79 400 ± 8700 Да. Інші білкові форми можна віднести до мінорних. Питома частка й молекулярна маса білків цих фракцій наступні: № 4 — 2,0 % (60 300 ± 6600 Да); № 5 — 4,3 % (69 200 ± 7600 Да), № 7 — 2,1 % (83 200 ± 9100 Да); № 8 — 0,6 % (89 100 ± 9800 Да).
Отже, у спектрі АБКЯ всього ідентифікуються вісім білкових фракцій у діапазоні молекулярних мас від 14,3 до 90 кДа. Молекулярна масаи основних білків — 40–50 кДа (дві третини всіх білків АБКЯ) і 80 кДа (понад 15 % всіх білків). У результаті ідентифікації фракцій протеїнів АБКЯ встановлено, що, згідно з даними літератури, основними білками, які проявляють алергенну активність, є лізоцим (Gal d 4) — 2,5 %, овомукоїд (Gal d 1) — 16,9 %, овальбумін (Gal d 2) — 55,9 %, кональбумін (Gal d 3) — 15,7 %, a-ліветин (Gal d 5) — 4,3 % [7–9]. Компоненти, що не ідентифікуються, становлять 4,8 %. Слід зазначити наявність 2 субфракцій овальбуміну: I-ova і S-ova (3а і 3b), що є його стабілізованими формами [8]. Отримані кількісні співвідношення між окремими фракціями АБКЯ узгоджуються з поданими в літературі [7–10].


На відміну від АБКЯ препарат АХП характеризується більшою кількістю білкових форм, а також ширшим діапазоном молекулярних мас (табл. 2, рис. 1б).
В електрофоретичному спектрі АХП можна виділити чотири зони: швидкорухливих білків (Rf від 0,45 до 0,52), рухливих (Rf від 0,33 до 0,39), з середньою рухливістю (Rf від 0,16 до 0,24) і зону малорухливих білків (Rf від 0,04 до 0,12) (рис. 3).
Як і в препараті АБКЯ, основна кількість білків АХП (понад 60 %) належить до низькомолекулярних форм (на рівні цитохрому С і менше), тобто препарат АХП характеризується переважанням невеликих білкових молекул.
Зона швидкорухливих білків препарату АХП має досить розмиті межі, що може, зокрема, свідчити про наявність різних білків із близькими значеннями маси. Комп’ютерна обробка дозволяє виділити в даній фракції принаймі три субфракції (рис. 3).
У зоні рухливих білків у спектрі АХП фракція № 2 становить близько 1/10 всіх білків препарату. Дана фракція чітко помітна на електрофореграмі. Молекулярна маса білків, що її утворюють, становить близько 14 кДа.
Решту білкових форм утворюють мінорні фракції, кожна з яких становить декілька відсотків від загальної кількості білка в препараті. Із них можна відзначити найменш рухливі форми (№ 11 і 12), які, незважаючи на незначну їх кількість, дають на еле-ктрофореграмах достатньо чіткі смуги. Молекулярна маса даних білків —
70 кДа і 80 кДа відповідно.
Ідентифікація фракційного складу АХП достатньо складна, оскільки це багатокомпонентна екологічна система, що складається як з органічних продуктів тваринного і рослинного походження, так і з різних форм мікросвіту. Склад цієї системи відрізняється в межах не тільки географічних регіонів, але й антропогенного сере­довища [2, 7]. Проте детальні дослідження хатнього пилу показали наявність мікрокліщів Dermatophagoides pteronissimus, для яких він є природним місцем існування [7, 11, 12 ]. Відзначено також, що основні алергенні фракції D.pteronissimus Der р 2 (молекулярна маса приблизно 16 кДа) і Der р 1 (молекулярна маса близько 25 кДа) ідентичні антигенному складу екстрактів із хатнього пилу [11]. Імовірно, фракції АХП № 3 і 5 можна ідентифікувати як відповідні антигени Der р 2 і Der р 1 мікрокліщів D.рteronissimus.

Висновки
На підставі проведених досліджень встановлено, що в комерційному препараті АБКЯ повністю представлені фракції білків, які мають алергійну активність; препарат АХП характеризується більшою кількістю білкових форм із широким діапазоном молекулярної маси, ідентифіковані антигени Der р 2 і Der р 1 мікрокліщів D.pteronissimus алергену хатнього пилу.


Bibliography

1. Пухлик Б.М. Элементарная аллергология. — Винница: Велес, 2002. —
148 с.
2. Райкис Б.Н., Казиев А.Х. Настоящее и будущее лечебных аллергенов. — М.: Триада-Х, 2001. — 246 с.
3. Клиническая иммунология и аллергология / Под ред. Г. Лолора-младшего, Т. Фишера и Д. Адельмана. — М.: Практика, 2000. — 806 с.
4. Якубке Х.Д. Аминокислоты, пептиды, белки. — М.: Наука, 1985. — С. 335-336.
5. Weber K., Osborn M.J. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis // J. Biol. Chem. — 1969. — № 244. — P. 4406-4412.
6. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4 // Nature. — 1970. — № 227. — P. 680-685.
7. Фрадкин В.А. Диагностические и лечебные аллергены — М.: Медицина, 1990. — 256 с.
8. Roy I., Rao M.V., Gupta M.N. An integrated process for purification of lysozyme, ovalbumin and ovomucoid from hen egg white // Appl. Biochem. Biotechnol. — 2003. — 111, № 1. —
P. 55-63.
9. Ebbenhoj K., Dahl A.M., Frokiaer H.
et al. Purification of egg-white allergens // Allergy. — 1995. — 50, № 2. —
P. 133-141.
10. Qirce S., Maranon F., Umpierrez A.
et al. Chicken serum albumin (Gal d 5) is a partially heat-labile inhalant and food allergen implicated in the bird-egg syndrome // Allergy. — 2001. — 56,
№ 8. — P. 754-762.
11. Eriksson T.L.I. Dust mite allergens: cloning, characterization and T-cell responses. — Stockholm: Repto print AB, 2001. — 66 p.
12. Мueller A.G., Benjamin D.C.,
Rule G.S. Structure of the major house dust mite allergen Der p 2: sequential and structural homologies // Biochemistry. — 1998. — 37. — P. 1207-1214. 


Back to issue