Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.



UkrainePediatricGlobal

UkrainePediatricGlobal

Журнал "Здоров`я дитини" 6(21) 2009

Повернутися до номеру

Влияние патогенетической иммунокоррекции на состояние антиэндотоксинового иммунитета у детей с септическим шоком и тяжелым сепсисом, вызванными грамотрицательной инфекцией

Автори: Притуло Л.Ф., Шаевский Д.В., Григорьева В.А., Астахов А.А., Мальцев В.Н., Ковалев В.А. Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского, г. Симферополь; Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького

Рубрики: Педіатрія/Неонатологія

Версія для друку


Резюме

Проведено исследование у 12 детей с диагнозом грамотрицательного септического шока и тяжелого сепсиса. Все пациенты были разделены путем случайной выборки на 2 группы. В 1-ю группу во­шли 6 детей, у которых проводилась патогенетическая иммунокоррекция с использованием плазмы доноров, обогащенной антителами к эндотоксину (ЭТ); во 2-ю группу — 6 детей, у которых проводилось только комплексное лечение. Тяжелый сепсис и септический шок при грамотрицательной инфекции приводят к резкой девиации антиэндотоксинового иммунитета, которая проявляется иммунодефицитом специфических анти-ЭТ-IgМ и ростом первичных (низкоаффинных) анти-ЭТ-IgМ в ассоциации с избыточной активацией неспецифических компонентов LBP и sCD14. В группе детей, которым проводилась иммунокоррекция плазмой доноров, обогащенной антителами к эндотоксину, на 7-е сутки наблюдается позитивная динамика показателей, характеризующаяся повышением анти-ЭТ-IgМ и снижением sCD14 со следующим повышением анти-ЭТ-IgМ и снижением анти-ЭТ-IgA, sCD14 и LBP на 14-е сутки.


Ключові слова

эндотоксин, иммунитет, грамотрицательный сепсис, иммунокоррекция.

Лечение критических состояний у детей остается сложной проблемой современной интенсивной медицины, что обусловлено высокой частотой развития синдрома полиорганной недостаточности и сохранением высокой летальности. Летальность при септическом шоке у детей при отсутствии квалифицированной помощи может достигать 80 % [1].

В последние годы очень активно изучается эндо­токсин грамотрицательной инфекции в инициации септического процесса. Так, связывание эндотокси­на с липополисахарид-связывающим белком (lipopoly­saccharide binding protein, LBP), который обладает вы­соким аффинитетом к липиду А и опосредует взаимо­действие эндотоксина с мембраносвязывающим рецеп­то­ром CD14 и TLR4 (toll-like receptor 4) на клетках моно­цитарно-макрофагального ряда, потенцирует выработку этими клетками провоспалительных цитокинов [2, 3].

Во многих исследованиях показано, что эндотелиальные клетки испытывают недостаток в mCD14 и отвечают на эндотоксин прежде всего через растворимую форму (sCD14) этого рецептора [4].

Таким образом, к гуморальным неспецифическим механизмам индукции антиэндотоксинового иммунитета можно отнести LBP и sCD14.

К гуморальным механизмам деактивации эндотоксина можно отнести естественные антиэндотоксиновые антитела. Известно, что важную роль в клиренсе липополисахарида как непосредственно в слизистых, так и в кровотоке играют антиэндотоксиновые антитела (анти-ЭТ-АТ). Более того, антитела к консервативным частям молекулы ЭТ можно рассматривать как универсальный интегральный маркер, одновременно отражающий реакцию организма на поступление ЭТ и характеризующий врожденный и приобретенный иммунитет к грамотрицательным микроорганизмам [5, 6].

Целесообразность включения внутривенных иммуноглобулинов в терапию при тяжелом сепсисе (IgG и IgG + IgM) связана с их возможностью ограничивать избыточное действие провоспалительных цитокинов, повышать клиренс эндотоксина, устранять анергию, усиливать эффект бета-лактамных антибиотиков. Использование внутривенных иммуноглобулинов в рамках иммунозаместительной терапии тяжелого сепсиса и септического шока является в настоящее время единственным реально доказанным методом иммунокоррекции при сепсисе, повышающим выживаемость [7–11].

В литературе практически не раскрыты механизмы влияния специфической пассивной иммунокоррекции с использованием плазмы доноров, обогащенной антителами к эндотоксину, на состояние антиэндотоксинового иммунитета у детей с грам­отрицательным септическим шоком и тяжелым сепсисом.

В связи с этим целью нашей работы стало изучение влияния патогенетической иммунокоррекции на состояние антиэндотоксинового иммунитета у детей с септическим шоком и тяжелым сепсисом, вызванных грамотрицательной флорой.

 

Материалы и методы

Для изучения влияния патогенетической иммунокоррекции на состояние антиэндотоксинового иммунитета при септическом шоке и тяжелом сепсисе, вызванными грамотрицательной флорой, проведено исследование у 12 детей, госпитализированных в хирургическое отделение Республиканской детской клинической больницы г. Симферополя.

В соответствии с клиническими диагнозами было исследовано 5 детей с острым гематогенным остеомиелитом, 7 — с перитонитом.

Для проведения патогенетической иммунокоррекции все пациенты были разделены путем случайной выборки на 2 группы. В 1-ю группу (метод 1) вошли 6 детей, у которых проводилась патогенетическая иммунокоррекция с использованием плазмы доноров, обогащенной антителами к эндотоксину; во 2-ю группу (метод 2) — 6 детей, у которых проводилось комплексное лечение без иммунокоррекции.

Комплексное лечение включало: хирургические пособия, антибактериальную терапию, интенсивную терапию, реабилитацию.

Иммунокоррекция проводилась на 2–3-е сутки с использованием регионального банка плазмы постоянных доноров, обогащенной антителами к эндотоксину. Заготовка, транспортирование и методы введения плазмы соответствовали рекомендациям МЗ Украины и Академии медицинских наук Украины.

Контрольную группу составили 110 условно здоровых детей того же возраста и пола.

Для определения септического шока была использована классификация, принятая на конференции IPSSC в 2005 г. [12].

J.A. Carcillo с коллегами определили септический шок в педиатрии как тахикардию (которая может отсутствовать у пациентов с гипотермией) с признаками пониженной перфузии (снижение периферического пульса по сравнению с центральным, время капиллярного наполнения более 2 секунд, влажные и холодные конечности, сниженный диурез) [13]. У детей гипотензия является признаком позднего, декомпенсированного шока. Она хоть и не имеет значения в определении, но подтверждает состояние шока, если присутствует у ребенка с подозреваемой или доказанной инфекцией.

Уровни антиэндотоксиновых антител классов А, М, G (соответственно анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM и анти-ЭТ-IgG) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа [14]. В качестве антигена использовали липополисахарид грам­отрицательной энтеробактерии Escherichia coli K30 (O9:K30:H12), выделенной из бактериальной биомассы методом водно-фенольной экстракции и дополнительно очищенной от примесей РНК обработкой цетавлоном (Serva, Германия). Уровни анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM и анти-ЭТ-IgG выражали в условных единицах оптической плотности конечного продукта ферментативной реакции для разведения тестируемой сыворотки крови 1 : 50 (для анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM) и 1 : 200 для анти-ЭТ-IgG.

Для исследования LBP и sCD14 использовали тест-системы Hbt Human LBP ELISA Kit, Product Number: HK315 и Hbt Human sCD14 ELISA Kit, Product Number: HK320 производства Hycult biotechnology (Голландия). Образцы и стандартные растворы инкубировали в титрационном микропланшете покрытыми антителами против LBP или sCD14. Во время инкубации LBP или sCD14 связывались с антителами, несвязанный материал извлекался вымыванием. Биотинилированные вторые антитела к LBP или sCD14 добавлялись в микропланшеты, после чего проводили вторичную отмывку. Стрептавидин-пероксидазный конъюгат добавляли в образцы, после чего остаток удаляли повторным вымыванием, останавливали реакцию добавлением лимонной кислоты. Оптическую плотность определяли на анализаторе StatFox 2100 на длине волны 450 нм [15]. Содержание LBP и sCD14 выражали в мкг/мл.

Все полученные результаты подвергнуты статистической обработке для параметрических и непараметрических критериев с использованием программы MedStat (серийный № MS0011) ДНПП ООО «Аль­фа», г. Донецк.

При анализе для проверки распределения на нормальность использовали Хи-квадрат и критерий W Шапиро — Уилка, сравнение центральных тенденций двух независимых выборок с использованием W-критерия Вилкоксона и сравнение средних двух независимых выборок по критерию Стьюдента. Для множественного сравнения использовали ранговый однофакторный анализ Крускала — Уоллиса и критерий Данна [16].

 

Результаты и их обсуждение

Анализ динамики показателей антиэндотоксинового иммунитета у детей с септическим шоком и тяжелым сепсисом представлен в табл. 1.

При анализе этих показателей на 1-е сутки (табл. 1) были выявлены следующие закономерности: уровень анти-ЭТ-IgG был достоверно ниже (Р < 0,01) контроля для групп с методом 1, 2; в свою очередь, уровни анти-ЭТ-IgM, анти-ЭТ-IgA, LBP и sCD14 были достоверно выше (Р < 0,01) контроля. Следует отметить, что исследуемые показатели на 1-е сутки достоверно не отличались между группами с методом лечения 1, 2.

Анализируя данные, полученные на 1-е сутки, можно утверждать, что тяжелый сепсис и септический шок приводят к резкой девиации антиэндотоксинового иммунитета, которая проявляется, с одной стороны, иммунодефицитом специфических анти-ЭТ-IgG и возрастанием первичных (низкоаффинных) анти-ЭТ-IgM, с другой стороны, чрезмерной активацией неспецифических компонентов LBP и sCD14. Наблюдаемое возрастание уровней анти-ЭТ-IgA для групп с методом лечения 1, 2 является, очевидно, генетически детерминированным процессом или возможностью использования гуморальных форм анти-ЭТ-IgA для образования секреторных, которые выполняют важную роль в протекции проникновения эндотоксина через слизистые барьеры.

На 7-е сутки показатели антиэндотоксинового иммунитета (табл. 1), для групп с методом лечения 1, 2 по отношению к контролю сохранили статистические связи, установленные на 1-е сутки. Однако для метода лечения 1 по сравнению с методом 2 были установлены совершенно новые закономерности: уровень анти-ЭТ-IgG для метода 1 был достоверно выше (Р < 0,01) по сравнению с методом 2; а уровень sCD14 достоверно ниже (Р < 0,01) при аналогичном сравнении.

Заключительным этапом работы стал анализ данных показателей на 14-е сутки (табл. 1). По отношению к контролю для групп с методом лечения 1, 2 все показатели антиэндотоксинового иммунитета сохранили статистические связи, установленные на 1-е, 7-е сутки. Установленное возрастание уровня анти-ЭТ-IgG на 7 сутки (0,167 ± 0,013) было еще более ярко выраженным на 14-е сутки (0,249 ± 0,015) для группы с методом 1. Уровень анти-ЭТ-IgA для группы с методом 1 достоверно снижался (Р < 0,01) по сравнению с группой метода 2. Значения показателей неспецифического, адаптивного антиэндотоксинового иммунитета LBP и sCD14 в группе детей с методом 1 (использование плазмы доноров, обогащенной антителами к эндотоксину) на 14-е сутки резко снижаются по сравнению с группой метода 2 (комплексное лечение без иммунокоррекции).

Таким образом, установленный факт девиации иммунного ответа на эндотоксин при грамотрицательном септическом шоке и тяжелом сепсисе на первые сутки значительно нивелируется при использовании иммунокоррекции на 7-е, 14-е сутки.

 

Выводы

1. Тяжелый сепсис и септический шок при грам­отрицательной инфекции приводят к резкой девиации антиэндотоксинового иммунитета, которая проявляется иммунодефицитом специфических анти-ЭТ-IgG и возрастанием первичных (низкоаффинных) анти-ЭТ-IgM в ассоциации с чрезмерной активацией неспецифических компонентов LBP и sCD14.

2. В группе детей, которым проводилась иммунокоррекция плазмой доноров, обогащенной антителами к эндотоксину, на 7-е сутки наблюдается положительная динамика показателей, характеризующаяся повышением анти-ЭТ-IgG и снижением sCD14 с последующим повышением анти-ЭТ-IgG и снижением анти-ЭТ-IgА, sCD14 и LBP на 14-е сутки.

Перспективы дальнейших исследований. С учетом полученных данных о реагировании антиэндотоксинового иммунитета и влияния иммунокоррекции с использованием плазмы доноров, обогащенной антителами к эндотоксину, у детей с септическим шоком и тяжелым сепсисом планируется изучение  клинической эффективности данного метода лечения.


Список літератури

1. Martinot A.A., Lecler F., Crener C. et al. Sepsis in neonates and children: definition, epidemiology, and outcomes // Pediatr. Emerg. Care. — 1997. — Vol. 13. — P. 277-281.

2. Chen G., Li J., Ochani M., Rendon-Mitchell B., Qiang X.

et al. Bacterial endotoxin stimulates macrophages to release HMGB1 partly through CD14- and TNF-dependent mechanisms // J. Leukoc. Biol. — 2004. — Vol. 76, № 5. — P. 994-1001.

3. Gioannini T.L., Teghanemt A., Zarember K.A., Weiss J.P. Regulation of interactions of endotoxin with host cells // J. Endotoxin. Res. — 2003. — Vol. 9, № 6. — P. 401-408.

4. Frey E.A., Miller D.S., Jahr T.G., Sundan A., Bazil V., Espevik T., Finlay B.B., Wright S.D. Soluble CD14 participates in the response of cells to lipopolysaccharide // J. Exp. Med. — 1992. — Vol. 176. — P. 1665-1671.

5. Zapata-Quintanilla L.B., Palmeira P., Tino De-Franco M., Amaral J.A., Carbonare C.B., Carbonare S.B. Systemic antibody response to diarrheagenic Escherichia coli and LPS O111, O157 and O55 in healthy Brazilian adults // Scand. J. Immunol. — 2006. — Vol. 64(6). — P. 661-7.

6. Down J.F., Barclay G.R., Bennett-Guerrero E., Hamilton-Davies C. et al. A descriptive study of the variation in baseline levels of antiendotoxin core antibodies between US and UK populations // J. Endotoxin Res. — 2004. — Vol. 10, № 3. — P. 195-198.

7. Danner R.L., Elin R.I., Hoseini I.M. et al. Endotoxin determinations in 100 patients with septic shock // Clin. Res. — 1988. — Vol. 36. — P. 453-458.

8. Abraham E., Anzueto A., Gutierrez G. et al. Double blind randomized controlled trial of monoclonal antibody human tumor necrosis factor in treatment of septic shock // Lancet. — 1998. — Vol. 351. — P. 929-933.

9. Abraham E., Glauser M.P., Butler T. et al. Р55 tumor necrosis factor receptor fusion protein in the treatment of patients with severe sepsis and septic shock. A randomized controlled multicenter trial // JAMA. — 1997. — Vol. 277. — P. 1531-1538.

10. Albertson T.E., Panacek E.A., MacArthur R.D. et al. Multicenter evaluation оf a human monoclonal antibody to Enterobacteriaceae common antigen in patients with Gramnegative sepsis // Crit. Care Med. — 2003. — Vol. 31. — P. 419-427.

11. Alejandria M.M., Lansang M.A., Dans L.F., Mantaring J.B.V. Intravenous immunoglobulin for treating sepsis and septic shock (Cochrane review) // The Cochrane Library. — 2002. — Issue 4. Oxford: Update Software.

12. Goldstein B., Giroir B., Randolph A. et al. International pediatric sepsis consensus conference: Definitions for sepsis and organ dysfunction in pediatrics // Pediatr. Crit. Care Med. — 2005. — Vol. 6. — P. 2-8.

13. Carcillo J.A., Fields A.I. Task Force Committee members: Clinical practice variables for hemodynamic support of pediatric and neonatal patients in septic shock // Crit. Care Med. — 2002. — Vol. 30. — P. 1365-1378.

14. Гордієнко А.І., Білоглазов В.О. Патент 70193 А Україна МКІ 7 А61К31/01 Спосіб визначення антитіл до ліпополісахаридів грамнегативних бактерій; Заявл. 29.12.2003; Опубл. 15.09.2004, Бюл. № 9.

15. Tiirola T., Jaakkola A., Bloigu A., Paldanius M., Sinisalo J., Nieminen M.S., Silvennoinen-Kassinen S., Saikku P., Jauhiainen M., Leinonen M. Novel enzyme immunoassay utilizing lipopolysaccharide-binding protein as a capture molecule for the measurement of chlamydial lipopolysaccharide in serum // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. — 2006. — Vol. 54(1). — P. 7-12.

16. Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях. — К.: Морион, 2000 — 319 с.


Повернутися до номеру