Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.

"Child`s Health" 8 (35) 2011

Back to issue

Експресія рецептора CD14 на моноцитах і гранулоцитах периферичної крові дітей, хворих на бактеріальні ангіни і скарлатину

Authors: Римаренко Н.В. ДУ «Кримський державний медичний университет імені С.І. Георгієвського», м. Cімферополь

Categories: Pediatrics/Neonatology

print version


Summary

У роботі наведені результати дослідження експресії рецептора CD14 на моноцитах і гранулоцитах периферичної крові залежно від рівня ендотоксинемії кишкового походження у 90 дітей, хворих на бактеріальні ангіни і скарлатину різного ступеня тяжкості.

Summary. The results of research of the expression of CD14 receptor on monocytes and granulocytes in peripheral blood depending on the level of endotoxinemia of intestinal origin in 90 children with bacterial angina and scarlet fever of different severity are presented in the article.

Резюме. В работе представлены результаты исследования экспрессии рецептора CD14 на моноцитах и гранулоцитах периферической крови в зависимости от уровня эндотоксинемии кишечного происхождения у 90 детей, больных бактериальными ангинами и скарлатиной разной степени тяжести.


Keywords

Клітинні рецептори, ендотоксин, бактеріальна ангіна, скарлатина, діти.

Key words: cellular receptors, endotoxins, bacterial angina, scarlet fever, children.

Ключевые слова: клеточные рецепторы, эндотоксин, бактериальная ангина, скарлатина, дети.

У рамках сучасного підходу до дослідження механізмів розвитку токсикозу при інфекційних захворюваннях у дітей дуже перспективним є вивчення ендотоксинемії, пов’язаної з підвищеним проникненням ендотоксину (ЕТ) з кишечника в системний кровотік [1, 2]. Так, було показано, що в гострому періоді бактеріальних ангін і скарлатини у дітей розвивається ендотоксинемія кишкового походження, вираженість якої залежить від тяжкості основного захворювання [3]. Внаслідок цього токсемія, викликана дією збудників ангіни і скарлатини, може підсилюватися в результаті розвитку патофізіологічних реакцій, що запускаються ЕТ. Відомо, що ЕТ реалізує свої ефекти, зв’язуючись з різними клітинами макроорганізму [4]. Зокрема, моноцити/макрофаги експресують мембранний CD14-рецептор (мCD14), компонент рецепторного комплексу CD14/TLR4/MD2, що розпізнає ЕТ. На окремих гранулоцитах також виявляються рецептори мCD14, однак вони експресуються слабко. Крім того, існує розчинна форма CD14-рецептора (рCD14), що секретується в кров макрофагами і моноцитами [5, 6]. ЕТ, що являє собою ліпополісахарид (ЛПС), взаємодіє з ЛПС-зв’язуючим білком (ЛСБ) і розчинною формою CD14, після чого комплекс ЛПС — ЛСБ зв’язується з мCD14 на поверхні макрофагів. Оскільки мCD14 не має внутрішньоклітинного сигнального домену, то клітинна відповідь на ЛПС залежить від трансмембранного Toll-like-рецептора (TLR), а саме TLR4 [6, 7]. Проведення активаційного сигналу після зв’язування ЛПС є поштовхом до початку експресії генів цитокінів, NO-синтази і генів інших медіаторів, ферментів і регуляторних молекул запалення. У результаті відбувається активація всіх основних клітинних функцій, пов’язаних з розвитком фагоцитозу і представленням антигенів, продукцією NO і вільних форм кисню, синтезом низькомолекулярних медіаторів запалення і групи прозапальних цитокінів, до яких належать інтерлейкіни — ІЛ-1, -6, -18, фактор некрозу пухлини, інтерферони I типу, хемокіни. Одночасно активуються цитокіни, що стимулюють диференціювання Т-лімфоцитів хелперів I типу — ІЛ-12, -23, -27. У свою чергу, цитокіни відіграють провідну роль в індукції відповіді гострої фази запалення [5, 8–10]. Таким чином, динаміка клітинної активації, пов’язаної з розвитком ендотоксинемії, залежить від рівня експресії мCD14 моноцитами/макрофагами, який, у свою чергу, визначає динаміку синтезу ряду медіаторів запалення, тобто вираженість запальної відповіді.

Метою дослідження стало визначення щільності експресії рецептора CD14 на моноцитах і гранулоцитах периферичної крові у дітей, хворих на бактеріальні ангіни і скарлатину, залежно від рівня ендотоксинемії кишкового походження.

 

Матеріал і методи дослідження

Обстежені 90 хворих віком від 2 до 6 років, які перебували на лікуванні в КРУ «Дитяча інфекційна клінічна лікарня» м. Сімферополя за період 2005–2008 рр.

Усі обстежені діти були розподілені на 4 групи. До 1-ї групи ввійшли 34 хворі на бактеріальну ангіну середнього ступеня тяжкості, до 2-ї групи — 29 хворих із тяжкою формою ангіни, 3-тю групу становили 15 хворих із середньотяжкою формою скарлатини, до 4-ї групи ввійшли 12 хворих із тяжкою формою скарлатини, причому тяжкість була зумовлена розвитком бактеріальних ускладнень (синусит, лімфаденіт, отит, паратонзиліт) і метаболічних розладів. Матеріалом дослідження була периферична кров, яка забиралась у гострому періоді захворювання (при надходженні в стаціонар і на 2-гу — 3-тю добу перебування) та перед випискою зі стаціонару.

Групу порівняння становили 25 здорових дітей віком від 2 до 6 років.

Рівень експресії рецептора CD14 моноцитами і гранулоцитами периферичної крові визначали методом проточної лазерної цитофлуориметрії, використовуючи як флуоресцентно мічений ліганд кон’югат ЛПС E. coli K235 з флуоресцеїнізотіоціанатом і моноклональні антитіла (МКА) до антигену CD14, мічені фікоеритрином [11]. Для аналізу результатів використовували програмне забезпечення Partec FloMax V, 2,4d (Partec GmbH, Munster, Германия). Результат виражали в умовних одиницях флюоресценції (у.о.фл.).

Визначення кількісного вмісту ендотоксину в сироватці крові хворих здійснювали методом хромогенного аналізу за кінцевою точкою, за яким після змішування ЛАЛ-реактиву Endosafe® Endochrome з досліджуваним зразком вимірювали жовте забарвлення, що з’являється в реакційній суміші, за допомогою спектрофотометра при довжині хвилі 405–410 нм [3, 12]. Інтенсивність забарвлення була прямо пропорційною вмісту ендотоксину в зразку. Концентрацію ендотоксину в зразку визначали за калібрувальною кривою, а результат виражали в міжнародних одиницях ендотоксину/мл (МОЕ/мл).

 

Результати досліджень та їх обговорення

Як видно з табл. 1, показник експресії мембранного CD14-рецептора на моноцитах при надходженні до стаціонару підвищувався в групах хворих на ангіни як середньої, так і тяжкої форм (1-ша — 2-га групи) на 21 і 53 % відповідно (р < 0,05 — р < 0,001) порівняно з групою здорових дітей. При цьому показник у хворих із тяжкою формою ангіни на 26 % перевищував показник хворих із середньотяжкою формою (р2 < 0,01). У хворих на скарлатину (3-тя — 4-та групи) рівень експресії мCD14 також підвищувався на 37–42 % відповідно (р < 0,001), але при цьому вірогідно не залежав від ступеня тяжкості (р2 > 0,2). Така динаміка мCD14-рецептора у хворих усіх 4 груп цілком закономірна, оскільки на цьому самому етапі дослідження рівень ЕТ у сироватці крові був підвищений [3].

Показники експресії мCD14, отримані у хворих із середньотяжкими формами ангін і скарлатини до 3-го дня перебування в стаціонарі, виявилися схожими з результатами при надходженні. Рівень експресії мCD14 залишався підвищеним (р < 0,01) і вірогідно не відрізнявся від показника при надходженні, при цьому він узгоджувався з підвищеною концентрацією ЕТ в сироватці крові хворих на цьому етапі досліджень.

У той же час у хворих із тяжкими формами захворювань (2-га і 4-та групи) на тлі збільшення концентрації ЕТ удвічі показник рецепторної експресії на моноцитах, навпаки, помірно знижувався на 11–19 % відповідно (р1 < 0,05) порівняно з показником при надходженні, залишаючись при цьому вірогідно вищим за фізіологічну норму. Зниження щільності експресії рецептора у хворих цих груп може бути зумовлене розвитком функціональної нездатності моноцитів в умовах надмірної стимуляції мембранних рецепторів ендотоксином [10].

Відомо, що стимулюючий ефект на мононуклеарні фагоцити справляють лише низькі дози ЕТ, тоді як більш високі, навпаки, блокують їх основні функції [13]. Також є наукові дані про те, що в умовах ендотоксинемії порушується передача внутрішньоклітинного сигналу та змінюється цитоскелет моноцитів/макрофагів, що призводить до функціональної неповноцінності фагоцитів і їх депресії [14–16].

Згідно з результатами наших досліджень, щільність експресії мCD14, що залежить від рівня ендотоксинемії в сироватці крові хворих, непрямо пов’язана з тяжкістю перебігу основного інфекційного захворювання. Так, хоча концентрація ЕТ у сироватці крові мала тенденцію до наростання у хворих усіх 4 груп, однак у пацієнтів із тяжкими формами ангін і скарлатини вона була в 2 рази вищою, ніж у хворих із середньою тяжкістю, що призводило до порушення функціональної здатності моноцитів експресувати мCD14 у хворих із тяжкими формами захворювання.

Слід зазначити, що, з одного боку, зниження здатності моноцитів експресувати мCD14 при тяжкому перебігу інфекційного захворювання може призвести до зриву імунної відповіді, починаючи з неадекватного синтезу медіаторів запалення і закінчуючи порушенням антитілопродукції, що небезпечно в плані розвитку ускладнень і можливої генералізації інфекційного процесу. З іншого боку, цей феномен може бути неспецифічним захисним механізмом, що має на меті попередження розвитку неконтрольованого запального каскаду, так званої медіаторної бурі, внаслідок якої розвиваються шок і поліорганна недостатність (ПОН). Більшість досліджень, що свідчать про негативний вплив зниження щільності експресії мCD14, були проведені у хворих, які перебували в критичному стані. Зокрема, встановлено, що значне зниження щільності експресії мCD14 на моноцитах у хворих із тяжкими пневмоніями і сепсисом були в прямій залежності від летального наслідку захворювання [17, 18]. Крім того, доведено, що зниження експресії мCD14 і фагоцитарної активності моноцитів/макрофагів пов’язане зі зростанням ризику розвитку бактеріальних ускладнень у хворих [19, 20]. Ґрунтуючись на даних наукової літератури і результатах наших досліджень, можна зробити висновок, що помірне зниження щільності мCD14-рецептора на моноцитах у гострому періоді перебігу тяжкого інфекційного захворювання може відігравати компенсаторну роль, тоді як значне зниження експресії мCD14 свідчить про декомпенсацію механізму клітинної активації, є патологічним, що веде до повного зриву імунної відповіді і, в результаті, можливо, до фатального наслідку захворювання.

Під час виписки зі стаціонару рівень експресії CD14-рецептора на моноцитах відповідав фізіологічним показникам у більшості хворих, за винятком хворих із тяжкою формою скарлатини, у яких він залишався вищим за норму на 16 % (р < 0,02).

Аналізуючи динаміку експресії CD14-рецептора гранулоцитами, ми враховували первісно слабку здатність гранулоцитів на відміну від моноцитів експресувати CD14-рецептор [5]. На момент надходження до стаціонару у хворих 1–4-ї груп рівень експресії мCD14-рецептора підвищувався в середньому на 17–27 % (р < 0,01 — р < 0,001), вірогідно не відрізняючись залежно від ступеня тяжкості захворювання.

На 3-й день перебування в стаціонарі, під час найбільш вираженої ендотоксинемії, показник експресії мCD14 у хворих на ангіни (1-ша і 2-га групи) залишався підвищеним (р1 < 0,05 — р1 < 0,01) і вірогідно не відрізнявся від показника при надходженні. У той же час у хворих на скарлатину (3-тя і 4-та групи) він відповідав рівню здорових дітей.

На момент виписки зі стаціонару рівень експресії CD14-рецептора на гранулоцитах у хворих усіх 4 груп не відрізнявся від фізіологічного.

Таким чином, нами вперше виявлено, що у відповідь на підвищення рівня ендотоксину кишкового походження в системному кровотоку хворих на бактеріальні ангіни і скарлатину збільшувалася щільність експресії CD14-рецепторів на моноцитах периферичної крові, рівень якої прямо залежав від тяжкості захворювання. У гострому періоді хвороби, при наростанні концентрації ЕТ у сироватці крові хворих із тяжкими формами, рівень експресії мCD14-рецепторів помірно знижувався, що свідчило про пригнічення механізмів клітинної активації в умовах вираженої ендотоксинемії. Щільність експресії CD14-рецепторів на гранулоцитах периферичної крові хворих на ангіни і скарлатину при розвитку ендотоксинемії теж підвищувалась, однак через низьку здатність гранулоцитів експресувати мCD14-результати були не такі показові.

Висновки

1. Підвищення рівня ЕТ кишкового походження в сироватці крові дітей, хворих на бактеріальні ангіни і скарлатину, супроводжується збільшенням експресії CD14-рецептора на моноцитах і гранулоцитах периферичної крові в гострому періоді захворювання, що може підсилювати активність запального процесу і вираженість інфекційного токсикозу.

2. Установлена залежність між тяжкістю інфекційного процесу та ендотоксинзалежною активацією експресії мCD14 на моноцитах периферичної крові хворих.

3. Виявлено, що функціональна здатність моноцитів до експресії мCD14 пригнічується у хворих із тяжкими формами ангін і скарлатини в умовах розвитку вираженої ендотоксинемії, при цьому помірне зниження щільності експресії мCD14, очевидно, відіграє компенсаторну роль, попереджаючи розвиток медіаторної бурі, а значне — може бути ознакою декомпенсації і свідчити про зрив імунної відповіді та безпеку фатального наслідку хвороби.


Bibliography

1. Инфекционный процесс / Н.П. Чеснокова, А.В. Михайлов, Е.В. Понукалина [и др.]. — М.: Изд-во «Академия Естествознания», 2006. — http://www.rae.ru/publishing/mono07.html

2. Учайкин В.Ф. Инфекционные токсикозы у детей / В.Ф. Учайкин, В.П. Молочный. — М.: Изд-во РАМН, 2002. — 248 с.

3. Римаренко Н.В. Рівень ендотоксину кишкового походження в сироватці крові при бактеріальних ангінах, скарлатині і гнійних менінгітах у дітей / Н.В. Римаренко // Здоровье ребенка. — 2011. — № 1(28). — С. 90-93.

4. Яковлев М.Ю. Элементы эндотоксиновой теории физиологии и патологии человека / М.Ю. Яковлев // Физиология человека. — 2003. — Т. 29, № 4. — С. 154-165.

5. Ройт А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл: Пер. с англ. — М.: Мир, 2000. — 592 с.

6. Alexander C. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity / С. Alexander, E. T. Rietschel // J. Endotoxin. — 2001. — № 7. — Р. 167-202.

7. Абатуров А.Е. Молекулярные механизмы неспецифической защиты респираторного тракта: распознавание патоген-ассоциированных молекулярных структур / А.Е. Абатуров // Здоровье ребенка. — 2006. — № 3. — Электронная версия журнала, pediatric.mif-ua.com.

8. Jansky L. Dynamics of cytokine production in human peripheral blood mononuclear cells stimulated by LPS or infected by Borrelia / L. Jansky, Р. Reymanova, J. Kopecky // Physiol. Res. — 2003. — Vol. 52, № 5. — P. 593-598.

9. Белоглазов В.А. Экспрессия антигена CD14 на В-лимфоцитах периферической крови, протекающей на фоне дисбактериоза кишечника / В.А. Белоглазов, А.И. Гордиенко // Таврический медико-биологический вестник. — 2000. — № 1–2. — С. 9-12.

10. Рябиченко Е.В. Цитокинстимулирующая активность липополисахарида грамотрицательных бактерий и его роль в противоопухолевом иммунитете / Е.В. Рябиченко, В.М. Бондаренко, Л.Г. Веткова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. — 2005. — № 6. — С. 76-81.

11. Гордиенко А.И. Улучшенный метод получения флуоресцентного зонда для определения липополисахарид-связывающих рецепторов методом проточной лазерной цитофлуориметрии / А.И. Гордиенко // Таврический медико-биологический вестник. — 2007. — Т. 10, № 4. — С. 156-160.

12. Применение хромогенного LAL-теста по конечной точке для определения уровня эндотоксинемии / Е.Н. Егорова, М.А. Горшкова, М.А. Кузьмина [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. — 2008. — № 9. — С. 27.

13. Sander H. Diks Lipоpоlysaccharide recognition, internalisation, signalling and other cellular effects / Н. Sander // Journ. of Endotoxin Research. — 2001. — Vol. 7, № 5. — Р. 335-348.

14. Allen J.N. Changes in mononuclear phagocyte microtubules after endotoxin stimulation:I, Changes in microtubule stability / J.N. Allen, S.А. Moore, Z. Liao // Am. J. of Respiratory Cell and Molecular Biology. — 1997. — Vol. 16. — Р. 119-126.

15. Allen J.N. Changes in mononuclear phagocyte microtubules after endotoxin stimulation: II, Changes in microtubule composition / J.N. Allen, S.А. Moore, Z. Liao // Am. J of Respiratory Cell and Molecular Biology. — 1997. — Vol. 16. — Р. 127-132.

16. Ashton S.N. Alterations in macrophage G proteins are associated with endotoxin tolerance / S.N. Ashton, J. Hildebrandt // Biochimica Acta — Molecular Cell Research. — 1996. — Vol. 1312. — Р. 163-168.

17. Peripheral blood phagocyte CD14 and CD11b expression on admission to hospital in relation to mortality among patients with community-acquired infection / Н. Aalto, А. Takala, Н. Kautiainen, Н. Repo // Inflamm. Res. — 2005. — Vol. 54, № 10. — Р. 428-434.

18. Monocyte CD14 and soluble CD14 in predicting mortality of patients with severe community acquired infection / H. Aalto, A. Takala, H. Kautiainen [et al.] // Scandinavian Journal of Infectious Diseases. — 2007. — Vol. 39, № 6–7. — P. 596-603.

19. Effects of epidural anaesthesia on surgical stress-induced immunosuppression during upper abdominal surgery / Т. Kawasaki, М. Ogata, С. Kawasaki [et al] // Br. J. Anaesth. — 2007. — Vol. 98, № 6. — Р. 847-848.

20. The influence of CD14 genomic polymorphism on CD14 gene expression as well as protein release and its clinical significance in patients with extensive burns / J. Lin, Y.M. Yao, Z.H. Huang [et al.] // Zhonghua Wai Ke Za Zhi. — 2006. — Vol. 44, № 13. — Р. 907-910.


Back to issue