Журнал "Здоров`я дитини" 4 (39) 2012
Повернутися до номеру
Бета-дефензини у локальному антихелікобактерному захисті слизової оболонки шлунка в дітей
Автори: Завгородня Н.Ю. - Комунальний заклад «Міська дитяча клінічна лікарня № 1 Дніпропетровської обласної ради»
Рубрики: Педіатрія/Неонатологія
Розділи: Клінічні дослідження
Версія для друку
У статті наведені дані дослідження продукції місцевих факторів уродженого мукозального захисту — бета-дефензинів при хронічних НР-асоційованих гастритах у дітей.
В статье представлены данные исследования продукции местных неспецифических защитных факторов — бета-дефензинов при хронических НР-ассоциированных гастритах у детей.
In the article there are presented the findings of investigation of production of local non-specific protective factors — beta-defensins in chronic Hp-associated gastritis in children.
хронічний гастрит, НР-інфекція, бета-дефензини, діти.
хронический гастрит, НР-инфекция, бета-дефензины, дети.
chronic gastritis, HP-infection, beta-defensins, children.
Хелікобактерна інфекція є однією з найпоширеніших бактеріальних інфекцій людини, майже 50 % населення земної кулі є інфікованими Helicobacter pylori (HP) [1, 4]. Загальновизнаною є провідна роль НР у розвитку гастриту та виразкової хвороби [4, 5], а Міжнародною агенцією з вивчення раку Всесвітньої організації охорони здоров’я цей збудник визначений як канцероген I порядку на підставі даних його зв’язку з розвитком аденокарциноми та MALTлімфоми шлунка [3].
Колонізація НР слизової оболонки шлунку (СОШ) людини може відбуватися вже в ранньому дитячому віці і, найімовірніше, пов’язана із внутрішньородинною передачею збудника [12, 13, 15, 17, 19].
Інфікування штамами, що містять у геномі цитотоксинасоційований ген А (СagA — cytotoxinassociated gene A), за даними багатьох досліджень, характеризується більш агресивним перебігом захворювання, що є наслідком реалізації цитопатичних ефектів транслокації імунодомінантного протеїну СagA HP в епітеліоцити СОШ — перебудови цитоскелету, порушення щільних міжклітинних сполучень, змін проліферативного потенціалу й полярності епітеліоцитів шлунка, активації транскрипційних факторів та індукції синтезу прозапальних цитокінів [2, 6, 9, 10, 13, 14, 18, 21].
Ключовими компонентами системи вродженого захисту СОШ, що активуються негайно після контакту з патогенасоційованими молекулярними структурами HP і забезпечують безпосередню антибактеріальну дію, є бетадефензини — представники сімейства амфіфільних, катіонних пептидів із молекулярною вагою 3–4 kDa, що містять багато цистеїнових залишків, стабілізованих трьома дисульфідними зв’язками в певну просторову структуру — антипаралельний бетаскладчастий лист [1, 20]. Дані багатьох досліджень свідчать, що бетадефензини є також важливими елементами клітинноопосередкованого адаптивного імунітету, тобто мають здатність залучати до вогнища запалення імунні клітини, регулювати процеси відновлення [8, 16].
Дослідження на тваринних моделях та у клінічних експериментах підтвердили значення НРіндукованої експресії бетадефензину2 (hBD2) у патогенезі запальних уражень шлунка та продемонстрували безпосередню участь hBD2 в ефективному кілінгу НР [6, 7, 10, 22].
Метою нашого дослідження було визначення ролі бетадефензину2 у механізмах локального антихелікобактерного захисту шляхом оцінки концентрації hBD2 у шлунковому вмісті залежно від CagAстатусу.
Матеріали та методи дослідження
Під спостереженням перебувало 79 пацієнтів віком від 9 до 17 років, хворих на хронічний гастрит, які лікувалися в гастроентерологічному відділенні КЗ «Міська дитяча клінічна лікарня № 1 ДОР» протягом 2009–2010 рр. Усім пацієнтам була проведена фіброезофагогастродуоденоскопія (Pentax FG15W, Японія) зі швидким уреазним тестом (Хелпілтест, ООО «АМА», Росія, СанктПетербург). За наявності H.pylori всі досліджувані пацієнти були розділені на 2 групи: Нрпозитивні та Нрнегативні. У свою чергу, Нрпозитивні пацієнти за виявленням у сироватці сумарних антитіл до цитотоксинасоційованого гену А (CagA) Нр були поділені на CagAпозитивні та CagAнегативні. Таким чином, сукупність Нрнегативних спостережень склала контрольну групу. Дані розподілу пацієнтів наведені в табл. 1.
Визначення hBD2 у шлунковому вмісті проводили за методикою вестернблоту. Для виділення hBD2 зі зразків шлункового соку використовували метод зворотнофазової хроматографії із застосуванням як рухливої фази ацетонітрилу (CH3CN), підкисленого 0,05% трифтороцтовою кислотою до pH 2,5. Отримані фракції збирали, ліофільно висушували та розчиняли в мінімальному об’ємі деіонізованої води (50 мкл) з наступним проведенням електрофорезу отриманих зразків у поліакриламідному гелі з підготуванням проб за Лемлі. Після електрофоретичного розділення та відмивання проводили електроперенос білків на нітроцелюлозну мембрану протягом 18 год при напруженості поля 60 В. Для блокування сайтів неспецифічного зв’язування антитіл нітроцелюлозну мембрану інкубували з розчином 1% ембріональної сироватки протягом 1 години, після чого відмивали PBSTбуфером та інкубували з моноклональними антитілами (Інститут онкології АМН, Україна), специфічними до бетадефензину2 людини протягом 2,5 години [11]. Для візуалізації за допомогою реакції фотолюмінесценції в системі ICL додавали антитіла (кон’югат), мічені пероксидазою хрону, та інкубували протягом 1 години. Для проявлення нітроцелюлози використовували концентрат ECL. Проявляли блот, використовуючи рентгенівську плівку та стандартні реактиви для проявлення рентгенівських плівок (ОНИКО, Україна) (рис. 1).
Статистична обробка отриманих даних проводилася в програмі SPSS Statistica 17.0. Для встановлення статистично значущих зв’язків у випадку нормального розподілу даних використовувався параметричний tкритерій Стьюдента, у випадку відхилення від нормального розподілу — непараметричний Uкритерій Манна — Уїтні. Значущим вважався зв’язок при рu,t < 0,05.
Результати та їх обговорення
Середній вік пацієнтів основної групи становив 13,47 ± 2,56 року, контрольної — 14,32 ± 2,09 року. Вірогідну відмінність за показником середнього віку мали лише CagAнегативні пацієнти (12,74 ± 2,51 року, pt = 0,032) (табл. 2).
Аналіз вікової структури продемонстрував зростання кількості випадків НРасоційованої патології шлунка з віком за рахунок збільшення частки CagAпозитивних пацієнтів (рис. 2).
У клінічній картині хворих на хронічний НРасоційований гастрит ступінь вираженості больового й диспептичного синдромів був вищим у групі CagAпозитивних пацієнтів (табл. 3).
Продукція hBD2 епітеліоцитами шлунка спостерігалась як серед НРпозитивних, так і серед Нрнегативних пацієнтів, але частота зустрічальності ознаки була вірогідно вищою в основній групі (pu < 0,05), що збігається з даними інших авторів та свідчить про індуцибельність продукції hBD2 та зв’язок її з НРстатусом [1, 9, 22]. Частота зустрічальності виявлення hBD2 серед пацієнтів основної та контрольної груп наведена на рис. 3.
Аналізуючи середні рівні концентрації hBD2 у шлунковому вмісті досліджуваних пацієнтів, слід звернути увагу на значущі відмінності цього показника між основною та контрольною групами (рu = 0,018). Крім того, пацієнти, інфіковані CagAпозитивними штамами НР, характеризуються вірогідно вищими рівнями hBD2 порівняно з НРнегативними пацієнтами (рu = 0,017), тобто штами Нр, що містять CagAген, є більш потужними індукторами синтезу hBD2, що підтверджується даними інших дослідників [10, 21]. Дані, що характеризують рівні hBD2, наведені в табл. 4.
Аналізуючи вікові особливості продукції hBD2, слід відзначити зниження концентрації hBD2 у шлунковому вмісті пацієнтів 12–14 років незалежно від наявності CagAгену, що може свідчити про певні вікові особливості реагування імунної системи у цьому віці (рис. 4).
Гендерні особливості досліджуваних груп характеризувалися вищими рівнями hBD2 у хлопчиків, інфікованих CagAпозитивними штамами Нр, але відмінності не мали вірогідної значущості (pu = 0,194) (рис. 5).
Проведений аналіз зв’язку концентрації hBD2 з титрами специфічних сумарних антиСagAантитіл у сироватці СagAпозитивних пацієнтів продемонстрував наявність прямо пропорційної залежності між цими показниками, що зображена на рис. 6.
Таким чином, при дослідженні концентрації hBD2 у шлунковому вмісті дітей з НРасоційованою патологією шлунка та ДПК з урахуванням наявності Нр (Нрстатуса) та CagA (CagAстатуса) було виявлено статистично значущі відмінності CagA+Нрпозитивних та Нрнегативних пацієнтів стосовно частоти виявлення hBD2 (pu < 0,05 ), а також порівняно зі значеннями середніх рівнів концентрації hBD2 основної та контрольної груп (рu = 0,018), аналогічна тенденція спостерігалась при порівнянні CagAпозитивних пацієнтів із контрольною групою (рu = 0,017). Вірогідність зниження концентрації hBD2 у шлунковому вмісті пацієнтів 12–14 років порівняно з пацієнтами інших вікових груп також була підтверджена статистично. Була виявлена залежність між рівнями hBD2 у шлунковому вмісті та титром сумарних антиСagAантитіл у сироватці.
Висновки
1. Стан локального мукозального захисту СОШ при хронічних Нрасоційованих гастритах у дітей характеризується розвитком імунозапальних реакцій як на неспецифічному, так і на специфічному рівнях.
2. Характерною особливістю змін локального імунітету СОШ є продукція антимікробних протеїнів hBD2, що є максимально вираженою у CagA+Нрпозитивних пацієнтів.
3. Наявність зв’язку між рівнями hBD2 та антиСagAантитіл у сироватці є підтвердженням ролі hBD2 у механізмах взаємодії неспецифічної та адаптивної ланок імунітету.
Подяка
Автор висловлює щиру вдячність д.м.н, професору П.В. Погрібному (Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Е. Кавецького Національної академії наук України) за кваліфіковану допомогу у проведенні вестернблотаналізу.
1. Дефензины и дефензинзависимые заболевания [Текст] / А.Е. Абатуров, О.Н. Герасименко И.Л. Высочина и др. — Одесса: Издательство ВМВ, 2011. — 265 с.
2. A global overview of the genetic and functional diversity in the Helicobacter pylori cag pathogenicity island [Text] / P. Olbermann, C. Josenhans, Y. Moodley [et al.] // PLoS Genet. — 2010. — Vol. 16, № 8.
3. Amieva M.R. Helicobacter pylori. Взаимодействие хозяина и инфекции [Text] / Amieva M.R., ElOmar E.M. // Клиническая гастроэнтерология и гепатология. Украинское издание. — 2008. — Т. 1, № 2. — С. 91107.
4. Atherton J.C. Coadaptation of Helicobacter pylori and humans: ancient history, modern implications [Text] / Atherton J.C., Blaser M.J. // J. Clin. Invest. — 2009. — Vol. 119, № 9. — P. 247587.
5. Consequences of Helicobacter pylori infection in children [Text] / Pacifico L., Anania C., Osborn J.F. [et al.] // World J. Gastroenterol. — 2010. — Vol. 16, № 41. — P. 51815194.
6. Douraghi M. Immune responses to Helicobacter pylori infection in children with intellectual disabilities [Text] / Douraghi M., Goudarzi H., Nateghi Rostami M. [et al.] // Res. Dev. Disabil. — 2012. — Vol. 33, № 2. — P. 6639.
7. Grubman A. The innate immune molecule, NOD1, regulates direct killing of Helicobacter pylori by antimicrobial peptides [Text] / Grubman A., Kaparakis M., Viala J. [et al.] // Cell. Microbiol. — 2010. — Vol. 12, № 5. — P. 62639.
8. Helicobacter pylori dampens gut epithelial selfrenewal by inhibiting apoptosis, a bacterial strategy to enhance colonization of the stomach [Text] / H. Mimuro, T. Suzuki, S. Nagai [et al.] // Cell. Host Microbe. — 2007. — Vol. 2, № 4. — P. 250263.
9. Helicobacter pylori induces an antimicrobial response in rhesus macaques in a cag pathogenicity islanddependent manner [Text] / Hornsby M.J., Huff J.L., Kays R.J. [et al.] // Gastroenterology. — 2008. — Vol. 134, № 4. — P. 10491057.
10. James R. Rick In situ expression of cagA and risk of gastroduodenal disease in Helicobacter pylori infected children [Text] / James R. Rick, Matthew Goldman, Cristina SeminoMora [et al.] // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. — 2010. — Vol. 50, № 2. — P. 167172.
11. Markeeva N. Expression of betadefensin2 in human gastric tumors: a pilot study [Text] / Markeeva N., Lisovskiy I., Lyzogubov V. [et al.] // Exp. Oncol. — 2005. — Vol. 27, № 2. — P. 1305.
12. McMillan M. Intrafamilial Genotyping of Helicobacter pylori from Faecal DNA [Text] / McMillan M., Mackay W.G., Williams C.L. [et al.] // Gastroenterol. Res. Pract. — 2011. — Vol. 17, № 1.
13. MouradBaars P. Helicobacter pylori infection and childhood [Text] / MouradBaars P., Hussey S., Jones N.L. // Helicobacter. — 2010. — Vol. 15, S. 1. — P. 5359.
14. MurataKamiya N. Pathophysiological functions of the CagA oncoprotein during infection by Helicobacter pylori [Text] // Microbes Infect. — 2011. — Vol. 13, № 10. — P. 799807.
15. Okuda M. Helicobacter pylori infection in childhood [Text] / Okuda M., Fukuda Y. // Nihon Rinsho. — 2009. — Vol. 67, № 12. — P. 223944.
16. Pediatric Helicobacter pylori isolates display distinct gene coding capacities and virulence gene marker profiles [Text] / Talarico S., Gold B.D., Fero J. [et al.] // J. Clin. Microbiol. — 2009. — Vol. 47, № 6. — P. 16801688.
17. Queiroz D.M. Natural History of Helicobacter pylori infection in childhood: eightyear followup cohort study in an urban community in northeast of Brazil [Text] / Queiroz D.M., Carneiro J.G., BragaNeto M.B. [et al.] // Helicobacter. — 2012. — Vol. 17, № 1. — P. 239.
18. Tan S. Helicobacter pylori usurps cell polarity to turn the cell surface into a replicative niche [Text] / Tan S., Tompkins L.S., Amieva M.R. // PLoS Pathog. — 2009. — Vol. 5, № 5.
19. Tutar E. Endoscopic and histopathologic findings associated with H. pylori infection in very young children [Text] // Dig. Dis. Sci. — 2009. — Vol. 54, № 1. — P. 1117.
20. Underwood M.A. Defensinbarbed innate immunity: clinical associations in the pediatric population [Text] / Underwood M.A., Bevins C.L. // Pediatrics. — 2010. — Vol. 125, № 6. — P. 12371247.
21. Vitoriano I. Ulcerogenic Helicobacter pylori strains isolated from children: a contribution to get insight into the virulence of the bacteria [Text] / Vitoriano I., SaraivaPava K.D., RochaGonçalves A. [et al.] // PLoS One. — 2011. — Vol. 6, № 10. — P. 26265.
22. Vordenbäumen S. DefensinmRNA expression in the upper gastrointestinal tract is modulated in children with celiac disease and Helicobacter pyloripositive gastritis [Text] / Vordenbäumen S., Pilic D., Otte [et al.] // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. — 2010. — Vol. 50, № 6. — P. 596600.