Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.

International neurological journal 8 (62) 2013

Back to issue

Вплив трансплантації фетальної нервової тканини на дегенеративні процеси в дофамінергічних системах головного мозку щурів, спричинені тяжкою черепно-мозковою травмою

Authors: Бараненко Б.О. - ДУ «Інститут нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова НАМН України», м. Київ

Categories: Neurology

Sections: Clinical researches

print version


Summary

Проведено дослідження вмісту дофаміну гомованілінової кислоти та рівня експресії гена Вах у корі лівої та правої півкуль, гіпоталамусі, гіпокампі, стріатумі та середньому мозку щурів через 30 днів після експериментальної тяжкої черепно-мозкової травми та трансплантації фетальної нервової тканини. Встановлено, що тяжка черепно-мозкова травма призводить до зниження вмісту дофаміну в стріатумі, гіпоталамусі та корі лівої (травмованої) півкулі, а також підвищення рівня проапоптичного гена Вах у всіх досліджених структурах головного мозку, що свідчить про наявність деструктивних процесів у мозку тварин у віддаленому періоді після травми. Трансплантація фетальної нервової тканини експериментальним щурам із тяжкою черепно-мозковою травмою сприяла нормалізації досліджуваних показників.

Исследованы содержание дофамина, гомованилиновой кислоты и уровень экспрессии гена Вах в коре левого и правого полушарий, гипоталамусе, гиппокампе, стриатуме и среднем мозге крыс через 30 дней после экспериментальной тяжелой черепно-мозговой травмы и трансплантации фетальной нервной ткани. Установлено, что тяжелая черепно-мозговая травма приводит к снижению содержания дофамина в стриатуме, гипоталамусе и коре левого (травмированного) полушария, а также повышению уровня проапоптического гена Вах во всех исследованных структурах головного мозга, что указывает на наличие деструктивных процессов в мозге животных в отдаленный период после травмы. Трансплантация фетальной нервной ткани экспериментальным крысам с тяжелой черепно-мозговой травмой способствовала нормализации исследованных показателей.

The authors investigated dopamine and homovanillic acid contents and level of Bax gene expression in the left and right hemisphere cortexes, hypothalamus, hippocampus, striatum and midbrain of rats in 30 days after an experimental severe traumatic brain injury and fetal nervous tissue transplantation. It is found that severe traumatic brain injury leads to the decline of dopamine content in the striatum, hypothalamus and left (damaged) hemisphere cortex, as well as to the increase of proapoptotic Bax gene expression level in all investigated brain structures, that testifies to destructive processes in the brain of animals in a remote period after the injury. Fetal nervous tissue transplantation to experimental rats with severe traumatic brain injury provided the normalizations of investigated indexes.


Keywords

черепно-мозкова травма, трансплантація, фетальна нервова тканина, дофамін, апоптоз.

черепно-мозговая травма, трансплантация, фетальная нервная ткань, дофамин, апоптоз.

traumatic brain injury, fetal nervous tissue, transplantation, dopamine, apoptosis.

Вступ

Причиною розвитку різноманітних віддалених ускладнень після черепно-мозкової травми (ЧМТ) середнього та тяжкого ступенів тяжкості є тканинний дефіцит, що виникає внаслідок безпосереднього руйнування нервової тканини в місці удару, та вторинний тканинний дефіцит, який розвивається внаслідок порушення метаболічних процесів після ЧМТ, а саме: зміни енергетичного метаболізму, інтенсифікація переокислення ліпідів та протеолізу, що ініціюють процеси апоптозу та некрозу [1, 2]. Серед найбільш чутливих до травмування виділяють дофамінергічні нейрони головного мозку [3].

У літературі наведено дані про різний внесок зазначених механізмів загибелі клітин після травматичного ушкодження мозку [4 — 6]. Відстрочена загибель ней-ронів після ЧМТ більш пов’язана з процесами апоптозу нейронів та гліальних клітин, і саме апоптоз вважається визначальним фактором у патофізіології травматичної хвороби [7, 8]. Проте більшість проведених досліджень щодо загибелі клітин головного мозку після ЧМТ стосуються, як правило, гострого післятравматичного періоду, тоді як у віддалені терміни ці процеси залишаються менш вивченими.

Нині продовжується пошук молекул, здатних ефективно інгібувати каскадні механізми загибелі нейронів та компонентів нейроглії. Результати експериментальних досліджень підтверджують, що відновлення функцій ЦНС після ЧМТ відбувається із залученням особливих компенсаторних ресурсів нервової тканини — нейропластичності та нейрогенезу [9]. Оскільки саме на запобіганні вторинним наслідкам ЧМТ зосереджує сьогодні увагу практична медицина, то перспективним підходом для вирішення даної проблеми є трансплантація фетальної нервової тканини (ФНТ), адже цей метод відкриває можливість зниження тканинного та клітинного дефіциту, стимуляції нейропластичності.

Враховуючи важливу роль процесів апоптозу у патогенезі черепно-мозкової травми та особливу чутливість до впливу ЧМТ нейронів дофамінергічної системи мозку [10,11], ми вважали за доцільне вивчення рівня експресії проапоптичного гена Bax, а також умісту дофаміну та його основного метаболіту — гомованілінової кислоти (ГВК) у структурах головного мозку щурів, яким була нанесена тяжка ЧМТ (тЧМТ), та впливу на ці показники трансплантації фетальної нервової тканини (тФНТ).

Матеріали і методи дослідження

У дослідженнях використовували самців безпородних статевозрілих білих щурів масою 180–220 г, а також вагітних самок із 18-денними ембріонами.

Для моделювання тяжкої черепно-мозкової травми застосовували пружинний ударник, модифікований для нанесення травм малим лабораторним тваринам [12]. Удар наносили в ліву тім’яно-скроневу ділянку. При цьому тварин не фіксували.

Для трансплантації використовували фетальну нервову тканину сенсомоторної ділянки кори мозку 18-денних плодів щурів. Перед трансплантацією видаляли тканинний детрит, що утворився у травмованій ділянці. У лунку після хірургічної обробки вводили 2 мм3 ембріональної нервової тканини. Трансплантацію проводили через 2 години після нанесення тЧМТ. Для анестезії застосовували нембутал (4 мг/100 г живої ваги). Тварин експериментальних груп декапітували через 30 діб після нанесення травми та трансплантації одночасно з тваринами контрольної групи. Вилучену після декапітації тканину окремих структур головного мозку швидко заморожували у рідкому азоті.

Визначення вмісту дофаміну та ГВК здійснювали методом високоефективної рідинної хроматографії з електрохімічним детектуванням [13]. Хроматографію здійснювали на мікроколонковому хроматографі «Миллихром» (Росія). Ідентифікацію піків проводили за часом виходу піків відповідного стандарту.

Для визначення експресії гена Вах здійснювали екстракцію РНК фенольним методом за наявності детергентів та інгібіторів нуклеаз [14]; кДНК синтезували з використанням 1–2 мкг РНК та 100 нг оліго(дТ)12-18 в 10 мкл розчину, що містив 50 мм Трис-HCl, рН 8,3, 75 мм KCl, 3 мм MgCl2, 50 мм дитіотрейтолу, суміші дНТФ (1 ммоль кожного) та 200 од M-Mlv-зворотної транскриптази (рекомбінантної). Для визначення експресії гена Bax використовували такі праймери: 5’-CACCAGCTCTGAACAGATCATGA -3’ та 5’-TCAGCCCATCTTCTTCCAGATGGT-3’ [15], продукт ампліфікації становив 541 п.н. 35 циклів ампліфікації було здійснено при температурі відпалу 55 °C. Візуалізація продуктів ампліфікації проводилася за допомогою електрофорезу в 2% агарозному гелі.

Статистичну обробку даних проводили з використанням t-критерію Стьюдента.

Результати та їх обговорення

Для відповіді на питання про стан метаболізму дофамінергічних систем та наявність дегенеративних процесів у тканині мозку після тяжкої черепно-мозкової травми та трансплантації фетальної нервової тканини ми досліджували вміст дофаміну, гомованілінової кислоти, що є продуктом метоксилювання дофаміну, а також рівень експресії проапоптичного гена Bax в окремих структурах головного мозку щурів, а саме: у корі лівої (травмованої) та правої півкуль, гіпоталамусі, гіпокампі, стріатумі та середньому мозку.

Отримані результати вказують на наявність суттєвих дегенеративних процесів в окремих функціональних структурах головного мозку експериментальних тварин у віддаленому (через 30 діб) періоді після травмування. У місці удару — лівій корі через 30 діб після тЧМТ уміст дофаміну був на 23 % нижчий за даний показник в інтактних тварин, проте ця різниця не є статистично значимою; вміст гомованілінової кислоти у цьому відділу мозку знаходився на рівні контрольних значень (рис. 1).

Щодо експресії гена Bax, який є показником активності апоптотичних процесів, то її рівень у тканині кори травмованої півкулі мозку у 2,3 раза перевищував рівень контрольних показників. У корі правої півкулі вміст дофаміну через 30 діб після тЧМТ статистично вірогідно не відрізнявся від умісту дофаміну у тварин контрольної групи, тоді як уміст його метаболіту — ГВК у цьому відділі мозку травмованих тварин становив лише 62 % від контрольних значень, що може розцінюватися як компенсаторна реакція, спрямована на підтримання рівня нейромедіатору за рахунок зменшення швидкості його розпаду. При цьому рівень експресії проапоптичного гена Bax у корі правої півкулі тварин, що підлягали дії тЧМТ, значно (в 1,9 раза) перевищував даний показник в інтактних тварин, хоча ця різниця була дещо менш виражена порівняно з корою травмованої півкулі. У тварин, яким після тЧМТ була імплантована ФНТ, у тканині кори як лівої, так і правої півкулі головного мозку відмічається уповільнення активності процесів апоптозу.

У гіпоталамусі щурів із ЧМТ через 30 діб після її нанесення рівень дофаміну становив 67 % від рівня конт-рольних значень. Пропорційно зміні вмісту нейромедіатора змінювався і вміст його похідної — ГВК. Імовірно, що однією з причин недостатності дофамінової системи в гіпоталамусі при тЧМТ є досить висока інтенсивність апоптичних процесів у цій структурі мозку навіть через 30 діб після її нанесення, про що свідчить рівень експресії гена Вах (205 % порівняно з контрольною групою). Трансплантація фетальної нервової тканини сприяла підтримці рівня дофаміну та ГВК у межах контролю. Рівень експресії гена Вах у гіпоталамусі тварин, яким була трансплантована ФНТ, також значно знизився, але все ще перевищував показник контрольної групи. Враховуючи модулюючий вплив дофаміну на секреторну активність гіпоталамусу [16], можна зробити висновок, що зниження після тЧМТ його вмісту в даній структурі мозку є вагомою причиною порушення адекватного реагування функціональних систем у відповідь на зовнішній вплив. Запобігання таким процесам у цьому відділі мозку за допомогою тФНТ є перспективним для профілактики розвитку вторинних віддалених наслідків ЧМТ, що проявляються у вигляді ендокринних розладів.

Одним із найбільш поширених ускладнень ЧМТ, особливо серед дітей, є епілепсія, що може бути пов’язана з відносною функціональною недостатністю катехоламінергічних нейромедіаторних систем мозку, зокрема дофамінергічних. Відоме значення лімбічної системи у формуванні епілептиформних станів після черепно-мозкової травми [17]. Тому ми вважали за доцільне провести дослідження вмісту дофаміну та гомованілінової кислоти у гіпокампі — одній із важливих структур цієї системи. Згідно з наведеними даними, при ЧМТ не спостерігається статистично значимих відмінностей цих показників у групах травмованих та інтактних тварин. Рівень експресії проапоптичного гена Bax у гіпокампі щурів, яким була нанесена тЧМТ, перевищував контрольні значення на 53 %, що є менш вираженими змінами порівняно з іншими досліджуваними структурами мозку, а трансплантація ФНТ призводила до його нормалізації.

Післятравматичні зміни, як свідчать клінічні дані, у ряді випадків можуть провокувати паркінсонічні явища [18]. Численними дослідженнями доведено, що основне значення в регуляції рухової активності мають дофамінергічні системи мозку. Особлива роль в організації рухової функції належить нігростріатному дофамінергічному шляхові. Дегенерація цього шляху є основною гістологічною та біохімічною ознакою паркінсонізму [19, 20]. Зниження дофаміну в синаптичних закінченнях нігростріатного шляху має важливе значення у формуванні рухових розладів. Згідно з отриманими нами даними, після тяжкої ЧМТ уміст дофаміну та ГВК у стріатумі зазнає суттєвих змін. Так, рівень дофаміну через 30 діб після травми знижується в 1,6 раза, рівень ГВК — в 1,3 раза; тФНТ сприяє нормалізації рівня дофаміну та ГВК, чого не можна сказати про експресію проапоптичного гена: її рівень у стріатумі травмованих тварин, яким була здійснена трансплантація ФНТ, залишається вдвічі вищим за контрольний.

Результати дослідження вмісту дофаміну, гомованілінової кислоти та рівня експресії гена Bax у середньому мозку свідчать про те, що через 30 діб після травмування суттєвих змін у складі як цих нейромедіаторів, так і проапоптичного гена не спостерігається, а тФНТ призводить до незначного підвищення вмісту дофаміну та ГВК.

Таким чином, отримані дані свідчать про високу активність процесів апоптозу у більшості досліджених структур головного мозку та порушення нейромедіаторного забезпечення їх функціонування (особливо стріатума та гіпоталамуса) у віддаленому післятравматичному періоді. Введення фетальної нервової тканини сприяє гальмуванню процесів апоптозу та відновленню вмісту дофаміну в різних функціональних структурах.

Висновки

1. Тяжка ЧМТ призводить до зниження вмісту дофаміну у функціональних структурах головного мозку щурів через 30 діб після її нанесення, а саме: в стріатумі, гіпоталамусі та корі лівої (травмованої) півкулі (в 1,6; 1,5 та 1,3 раза відповідно).

2. Рівень експресії проапоптичного гена Вах у головному мозку щурів через 30 діб після тЧМТ перевищує контрольні значення у більшості досліджених структур головного мозку: у лівій (травмованій) корі, стріатумі та гіпоталамусі — більше ніж на 200 %, у гіпокампі та правій корі півкуль мозку — на 153 та 190 % відповідно.

3. Трансплантація алогенної фетальної нервової тканини сприє підтримці вмісту дофаміну у травмованій півкулі, гіпоталамусі та стріатумі в межах, близьких до контрольних, та зниженню (але не повній нормалізації) рівня експресії гена Вах у більшості досліджених структур головного мозку щурів.


Bibliography

1. Inci S. Time-level relationship for lipid peroxidation and the protective effect of alpha-tocopherol in experimental mild and severe brain injury / S. Inci, O.E. Ozcan // Neurosurgery. — 1998. — Vol. 43, № 2. — P. 330-335.

2. Sustained sensory/motor and cognitive deficits with neuronal apoptosis following controlled cortical impact brain injury in the mouse / G.B. Fox, L. Fan, R.A. Levasseur, A.I. Faden // J. Neurotrauma. — 1998. — Vol. 15, № 8. — P. 599-614.

3. The impact-acceleration model of head injury: injury severity predicts motor ancognitive performance after trauma / A. Beaumont, A. Marmarou, A.Czigner [et al.] // Neurol. Res. — 1999. — Vol. 21, № 8. — P. 742-754.

4. Апоптоз клітин мозку щурів різного віку при черепно-мозковій травмі і генній терапії / С.А. Михальський, Т.Ю. Квітницька-Рижова, В.В. Білошицький, С.П. Малишева // Пробл. старения и долголетия. — 2011. — Т. 20, № 4. — С. 371-380.

5. Трофимов А.О. Апоптоз нейронов при черепно-мозговой травме / А.О. Трофимов, Л.Я. Кравец // Современные технологии в медицине. — 2010. — № 3. — С. 92-97.

6. Raghupathi R. Cell death mechanisms following traumatic brain injury / R. Raghupathi // Brain Pathol. — 2004. — Vol. 14, № 2. — Р. 215-222.

7. Effect of post-traumatic mild hypothermia on hippocampal cell death after traumatic brain injury in rats / F. Jia, Q. Mao, Y.M. Liang, J.Y. Jiang // J. Neurotrauma. — 2009. — № 26. — P. 243-252.

8. Clinical trials in head injury / R.K. Narayan, M.E. Michel, B. Ansell [et al.] // J. Neurotrauma. — 2002. — № 19. — P. 503-557.

9. Шевага В.Н. Ранние и отдаленные последствия черепно-мозговой травмы: медико-социальные аспекты и возможности нейропротекции / В.Н. Шевага // Здоров’я України. — 2009. — № 5. — С. 45.

10. Kobori N. Enhanced catecholamine synthesis in the prefrontal cortex after traumatic brain injury: implications for prefrontal dysfunction / N. Kobori, G.L. Clifton, P.K. Dash // J. Neurotrauma. — 2006. — Vol. 23, № 7. — P. 1094-1102.

11. Impaired dopaminergic neurotransmission in patients with traumatic brain injury: a SPECT study using 123I-beta-CIT and 123I-IBZM / E. Donnemiller, C. Brenneis, J. Wissel [et al.] // Eur. J. Nucl. Med. — 2000. — Vol. 27, № 9. — P. 1410-1414.

12. Гельфанд В.Б. Закрытая черепно-мозговая травма / В.Б. Гельфанд, М.Д. Маламуд, В.Г. Истратов. — Кишинев: Штиинца, 1986. — 278 с.

13. Бонецкий А.А. Определение катехоламинов плазмы крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на микроколоночном хроматографе «Миллихром» / А.А. Бонецкий, В.И. Федоров // Лаб. дело. — 1989. — № 4. — С. 21-25.

14. Клеменс М. Выделение эукариотической матричной РНК (мРНК) / М. Клеменс // Транскрипция и трансляция. Методы: пер. с англ. [редкол.: Б. Хеймс, С. Хиггинс]. — М.: Мир, 1987. — C. 254-275.

15. Diminished penile expression of vascular endothelial growth factor and its receptors at the insulin-resistant stage of a type II diabetic rat model: a possible cause for erectile dysfunction in diabetes / Jesmin S., Sakuma I., Salahldin A. [et al.] // J. of Mol. Endocrino-logy. — 2003. — № 31. — Р. 401-418.

16. Митюшов М.И. Регуляция нейрогормональных функций гипоталамуса: Актуальные вопросы современной эндокринологии / М.И. Митюшов, А.А. Филаретов. — М.: Наука, 1981. — С. 82-94.

17. Отелин В.А. Функциональная морфология медиаторных систем головного мозга / Отелин В.А. // Журн. невр. и психиатр. — 1998. — № 1. — С. 54-58.

18. Patt S. Neuropathological sequelae of traumatic injury in the brain. An overview / S. Patt, N. Brodhun // Exp. Toxicol. Pathol. — 1999. — Vol. 51, № 2. — P. 119-123.

19. McKeran R.O. The biochemistry of diseases of the central nervous system / R.O. McKeran // Biochemical aspects of human disease [Ed. R.S. Elkells, A.S. Tavil]. — London — Edinburg: Oxford, 1983. — P. 435-480.

20. De Long M.R. Primate models of movement disorders of basal ganglia origin / M.R. De Long // Trends Neurosci. — 1990. — Vol. 13, № 7. — P. 281-285.


Back to issue