Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.


Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.

"Gastroenterology" 1 (59) 2016

Back to issue

Microstructural Changes in Hepatocytes against a Background of Liver Fibrosis in Patients with Chronic Diffuse Liver Diseases

Authors: Stepanov Yu.M., Haidar Yu.A., Didenko V.I., Halenko O.P., Oshmyanska N. Yu. - SI «Institute of Gastroenterology of NAMS of Ukraine», Dnipropetrovsk, Ukraine

Categories: Gastroenterology

Sections: Clinical researches

print version


Summary

Проведено морфологічний аналіз мікроструктурних змін гепатоцитів у хворих на хронічний вірусний гепатит С, розподілу маркерів апоптозу та білків цитоскелета на матеріалі 41 пункційної біо­псії печінки. За допомогою імуногістохімії та комп’ютерної морфометрії проаналізовано мікроструктурні зміни, що супроводжують прогресування фіброзу, вивчено особливості механізму апоптозу гепатоцитів, локалізації цитохрому С, зміни системи мікрофіламентів і скорочувальних властивостей актину з паралельною активацією процесів регенерації.

Проведен морфологический анализ микроструктурных изменений гепатоцитов у больных хроническим вирусным гепатитом С, распределения маркеров апоптоза и белков цитоскелета на материале 41 пункционной биопсии печени. С помощью иммуногистохимии и компьютерной морфометрии проанализированы микроструктурные изменения, которые сопровождают прогрессирования фиброза, изучены особенности механизма апоптоза гепатоцитов, локализации цитохрома С, изменения микрофиламентов и сократительных свойств актина с параллельной активацией процессов регенерации.

Morphological analysis of the microstructural changes of hepatocytes has been performed in patients with chronic C viral hepatitis; the distribution of apoptosis markers and cytoskeletal proteins has been analyzed on the material of 41 liver biopsies. Using immunohistochemical analysis and computer morphometry there have been investigated microstructural changes which accompany the progression of fibrosis, particularly the mechanisms of hepatocytes apoptosis, localization of cytochrome C, microfilaments changes and contractile properties of actin with parallel activation of regeneration processes.


Keywords

хронічний гепатит С, цитохром С, стелатні клітини печінки.

хронический гепатит С, цитохром С, стеллатные клетки печени.

chronic C viral hepatitis, cytochrome C, hepatic stellate cells.

Статтю опубліковано на с. 66-70

 

Вступ

При пошкодженні печінкової паренхіми на тлі хронічних дифузних захворювань печінки (ХДЗП) спостерігається поступове розростання або ущільнення сполучної тканини, що представлена екстрацелюлярним матриксом печінки (ЕМП). ЕМП — ​це біологічно активна пластична спеціалізована субстанція, що здатна швидко змінювати свій склад у відповідь на дію різних фізіологічних чинників [3].
Ряд досліджень доводить роль екстрацелюлярного матриксу в розвитку фіброзу багатьох органів [2]. Провідну роль як у синтезі, так і в деградації компонентів ЕМП відіграють стелатні клітині (СК) печінки. У нормальній печінці СК знаходяться в стані покою, постійно експресуючи певну кількість ЕМП, а також кілька типів металопротеїназ, які беруть участь у його деградації (протеолізі), що забезпечує нормальний кількісний і якісний склад компонентів у перисинусоїдальному просторі [5, 8].
Активація СК супроводжується суттєвим порушенням їх структури і функцій, включаючи втрату накопичення ретиноїдів, трансформацію в міофібробласти, проліферацію, міграцію в зони запалення і некрозу гепатоцитів, а також збільшення продукції цими клітинами компонентів ЕМП [1, 11, 12, 14].
Маркером активації і трансформації СК у міофібробласти є експресія гладком’язового α-актину (що є необхідним для морфогенезу і руху клітин), поява або збільшення на їх поверхні числа рецепторів до фактора росту, інших цитокінів та ендотелію, а також молекул клітинної адгезії [7, 9, 13]. Важливу роль у регуляції функцій СК печінки відіграють цитокіни, більшість з яких стимулює продукцію компонентів ЕМП. У свою чергу, активовані СК продукують ряд хемокінів, що підсилюють міграцію мононуклеарів і нейтрофілів у зони ушкодження печінки [6, 10].
При патології печінки спостерігаються суттєві зміни ЕМП, характер яких залежить від етіології і тривалості дії шкідливого чинника [5, 10]. При гострих ураженнях печінки розвивається типовий процес репаративної регенерації, властивий загоєнню ушкодження епітеліальної тканини, з розвитком спочатку запальної інфільтрації та подальшою активацією СК і трансформацією їх у міофібробласти, формуванням у зонах некрозу і запалення фібрилярного матриксу.
Надалі включаються механізми, спрямовані на деградацію фібрилярного матриксу та відновлення нормального складу ЕМП, а також регенерацію епітелію.
Після припинення дії етіологічного чинника у зонах пошкодження зменшується кількість міофібробластів у результаті їх апоптозу або зворотної трансформації у стелатні клітини [6].
З огляду на це метою нашої роботи було дослідити мікроструктурні зміни гепатоцитів при фіброзуванні печінки, зокрема розподіл маркерів апоптозу та білків цитоскелета.

Матеріали і методи

Обстежений 41 хворий, які проходили лікування у відділенні захворювань печінки та підшлункової залози ДУ «Інститут гастроентерології НАМН України» з приводу хронічного вірусного гепатиту, асоційованого з вірусом С (ХВГС).
Пункційні біоптати печінки фіксували в 10% формаліні, проводили через ряд спиртів, поміщали в парафін. Гістологічні зрізи товщиною 3–5 мкм забарвлювали гематоксиліном та еозином, а також за методом Маллорі в модифікації Слінченка. Для морфометричного аналізу було наведено 2 чи 3 стовпчики тканини, що містять від 4 до 6 портальних трактів. Імуногістохімічне (ІГХ) виявлення PCNA (1 : 200) (ядерний антиген проліферуючих клітин), Вт‑567 (1 : 200) (міозин, білок цитоскелета), цитохрому С (1 : 100) (фермент класу оксидоредуктаз), актину (1 : 100) (білок цитоскелета) проводили на депарафінованих гістологічних зрізах печінки.
Імуногістохімічні дослідження з використанням моноклональних антитіл виконувалися в парафінових зрізах тканини печінки. Після депарафінації зрізів пригнічували активність пероксидази 3% розчином перекису водню на 30 хв. Після блокування пероксидази препарати промивали і переміщали в забуферений фізіологічний розчин (рН 7,2–7,4) на 5–10 хв. Потім на зрізи наносили розчин специфічних антитіл (Chemicon, Santa Cruz, Abcam, USA) з 1% бичачого сироваткового альбуміну і залишали на ніч, при +4 °C у вологій камері.
На другий день зрізи промивали і наносили вторинні антитіла, мічені біотином (1 : 50). Після завершення інкубації вторинними антитілами залишки реагентів, які не прореагували, змивали буфером. Після промивання на зрізи наносили розчин кон’югату стрептавідину (1 : 150).
Після інкубації зрізи промивали у буфері і виявляли розчином 3,3'-діамінобензидину тетрагідрохлориду (0,01%) (DAB) з перекисом водню (0,06%). Під час реакції пероксидази з DAB у місцях локалізації виявленого антигену утворювався продукт імуногістохімічної реакції темно-коричневого кольору. Препарати дозабарвлювали гематоксиліном та монтували на предметні скельця.
Комп’ютерна морфометрія використовувалась як додатковий метод об’єктивізації морфологічного дослідження. Зрізи, забарвлені за методом Маллорі в модифікації Слінченка, фотографувалися при збільшенні 40 і 100 світлового мікроскопа XSP‑139TP (Ulab, Україна) фотоапаратом Canon PowerShot A630 (Японія). Ділянка паренхіми та фіброзу була виділена і виміряна за допомогою програмного забезпечення ImageJ 1.45S (National Institutes of Health, США). Після виміру проводився розрахунок комп’ютерного індексу фіброзу (КІФ) — ​відношення фіброзної тканини до загальної площі біоптату. При оцінці результатів ІГХ клітини, що прореагували позитивно, підраховувалися, а результат виражався в кількості клітин/мм2 видимої площі або на велике поле зору.
Для статистичного аналізу отриманого числового матеріалу використовували дескриптивну статистику та кореляційний аналіз за Пірсоном (для даних, що виражені в інтервальній шкалі) та Спірменом (для даних, що виражені в неінтервальних шкалах). Вірогідність відмінностей між групами аналізувалася за допомогою тесту Mann — ​Whitney U та критерію хі-квадрат. Вірогідним вважалося значення р < 0,05.

Результати дослідження

У першу групу увійшли хворі з ініціальною стадією фіброзу (58,33 % усіх випадків). Групу порівняння (група ІІ) становили хворі з прогресуванням викликаних фіброзом структурних змін печінки (41,67 %).
Із числа хворих І групи перша стадія фіброзу за шкалою METAVIR спостерігалась у 35,71 %, повна відсутність будь-яких фіброзних змін — ​у 7,14 % (одиничний випадок). Сполучна тканина являла собою перипортальні вузли невеликого розміру навколо незначно розширених портальних трактів, на тлі помірної ЛПІ перипортальної зони (рис. 1А); КІФ становив (0,0370 ± 0,0119) (від 0 до 8,4 %). У 57,14 % пацієнтів спостерігалась друга стадія фіброзу за шкалою METAVIR, що характеризувалась початком формування неповних портопортальних септ. У цьому разі перипортальна ділянка являла собою скупчення щільної сполучної тканини, інфільтрованої лімфоцитами та плазматичними клітинами (рис. 1Б); КІФ становив (0,0620 ± 0,0013) (від 3,2 до 11,8 %).
Серед хворих групи ІІ, з прогресуванням викликаних фіброзом структурних змін печінки, у 60,0 % випадків було діагностовано третю стадію фіброзу за шкалою METAVIR з характерним поширенням перигепатоцелюлярного фіброзу, скупченням сполучної тканини навколо портальних трактів і центральної вени, повними та неповними портопортальними і портоцентральними септами (рис. 2А). При цьому портальні тракти були помірно розширені, інфільтровані лімфоцитами і плазматичними клітинами, в окремих випадках спостерігалися некроз і фіброз гепатоцитів пограничної пластинки. КІФ становив (0,1930 ± 0,0318) (7,6–19,3 %).
І, нарешті, у 40,0 % випадків було встановлено цироз печінки або четверту стадію фіброзу за шкалою METAVIR (рис. 2Б). При цьому часточкова будова печінки була помітно порушена, відзначалися повні портопортальні і портоцентральні септи з утворенням мікро- і макронодулярних структур (вузлів). КІФ становив (0,2640 ± 0,0204) (20,4–29,2 %).
При порівнянні структурних змін печінки на ініціальних стадіях фіброзу (група І) і при його подальшому прогресуванні (група ІІ) не було встановлено вірогідних відмінностей в активності гепатиту (р = 0,266), а також характер і поширеність дистрофії гепатоцитів (р = 0,412). Як видно з табл. 1, хоча і спостерігається деяке зростання гістологічної активності гепатиту і поширеності дистрофічних змін печінки, тільки розрахунок КІФ є об’єктивним методом оцінки поширеності фіброзних змін. Так, у І групі КІФ становив (0,051 ± 0,008), а у другій — ​(0,223 ± 0,029), з підтвердженою статистично вірогідною різницею між групами (р = 0,001).
Таким чином, основною мікроскопічною ознакою активації фіброзу в циротично зміненій печінці було збільшення кількості дрібних і тонких фіброзних септ у часточках і псевдочасточках печінки, поява сегментарного перисинусоїдального фіброзу, а також поширення перипортального фіброзу. Для подальшого уточнення процесів, що лежать в основі структурної перебудови печінки при прогресуванні ХВГС, було проведено імуногістохімічне дослідження. У гепатоцитах, жовчних протоках, ендотеліальних клітинах синусоїдів було проаналізовано особливості локалізації цитохрому С, регенераційний потенціал і дифузний розподіл актину та міозину.
У поодиноких гепатоцитах спостерігалась транслокація цитохрому С із цитоплазми в ядро клітин, що демонструвалось інтенсивною реакцією в ядрах, яка свідчить про апоптичний стан клітин (рис. 3А). В ядрах клітин поодиноких гепатоцитів та ядрах клітин жовчних проток спостерігалась експресія PCNA (рис. 3Б).
Цитохром С — ​це білок із подвійною функцією. Він виступає одноелектронним переносником, вільно пов’язаним із внутрішньою мембраною мітохондрій, та необхідним компонентом дихального ланцюга, але за певних умов може від’єднуватися від мембрани, вільно збиратися у міжмембранному просторі мітохондрій та активувати апоптоз [12]. Його накопичення у великих кількостях при розвитку ХГВС вказує на активацію каспазного механізму апоптозу.
З іншого боку, збільшення кількості PCNA-позитивних клітин вказує на те, що при ХГС активується механізм репаративної регенерації печінки. Кількість клітин у стані регенерації досить широко різниться, тому можна припустити, що в деяких випадках регенераційний потенціал може досить довго забезпечувати відновлення структури печінки, у той час як в інших превалюючі механізми загибелі швидко ведуть до дистрофічних змін.
У більшості випадків (69,23 %) при стандартному морфологічному дослідженні відзначалася білкова дистрофія гепатоцитів різного ступеня вираженості, яка охоплювала від декількох клітин до великих зливних полів. При імуногістохімічному дослідженні експресія міозину спостерігалась в усіх гепатоцитах (рис. 4А), у той час як актин мав вигляд гранулярних включень у цитоплазмі поодиноких гепатоцитів, що перебували саме у стані білкової дистрофії (рис. 4Б).
Система «актин — ​міозин» є основою мікрофіламентів, що пронизують цитоплазму гепатоцитів і служать опорним скелетом клітини.
У змінених дистрофією гепатоцитах актин набуває вигляду гранулярних включень і визначає прогресування зернистої дистрофії при розвитку ХГВС.

Висновки

1. Розвиток фіброзування печінки у хворих на ХДЗП супроводжується інфільтрацією навколопортальних трактів (р = 0,076), точковими інтрачасточковими та перипортальними некрозами (р = 0,073) і крайовим стоянням лімфоцитів у синусоїдах (0,011). Крім того, хоча не виявлено прямого зв’язку між ступенем гістологічної активності та стадією фіброзу (r = 0,35; p = 0,09), для вираженого фіброзу характерна супутня висока активність гепатиту (р = 0,042).
2. Ядерна локалізація цитохрому С як маркера апоптозу клітин спостерігається в поодиноких гепатоцитах печінкових часточок, що вказує на активацію каспазного механізму апоптозу при прогресуванні розвитку ХВГС.
3. Виявлення поодиноких PCNA-позитивних гепатоцитів у печінкових часточках свідчить про активацію репаративної регенерації печінки при ХВГС.
4. У змінених дистрофією гепатоцитах актин набуває вигляду гранулярних включень в цитоплазмі, що пояснює втрату актином своїх скорочувальних властивостей при ХВГС.

Bibliography

1. Гаврилюк А.О. Клинико-морфологическая характеристика последствий леченого хронического вирусного гепатита В, С и В + С / Гаврилюк А.О., Туманський В.О., Пентюк Н.О. // Вісник проблем біології і медицини. — 2012. — ​Т. 2, № 3. — ​С. 183-186.

2. Ивашкин В.Т. Процессы апоптоза и пролиферации при патологии желудочно-кишечного тракта и печени / В.Т. Ивашкин, Т.Л. Лапина, О.Ю. Бондаренко и др. // Оригинальные исследования. — 2002. — ​Т. 6. — ​С. 33-38.

3. Assy N.I. Use of proliferating cell nuclear antigen as a marker of liver regeneration after partial hepatectomy in rats / Assy N.I., Gong Y., Zhang M. et al. // J. Lab. Clin. Med. — 1998 Mar. — ​Vol. 131(3). — ​Р. 251-6.

4. Delhaye M. Hepatocyte proliferative activity in human liver cirrhosis / M. Delhaye, H. Louis, C. Degraef et al. // J. Hepatol. — 1999 Mar. — ​Vol. 30(3). — ​Р. 461-71.

5. Kelman Z. PCNA: structure, functions and interactions / Kelman Z. // Oncogene. — 1997 Feb 13. — ​Vol. 14(6). — ​Р. 629-40.

6. Lake-Bakaar G.I. Digital image analysis of the distribution of proliferating cell nuclear antigen in hepatitis C virus-related chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. / Lake-Bakaar G. I., Mazzoccoli V., Ruffini L. // Dig. Dis. Sci. — 2002 Jul. — ​Vol. 47(7). — ​Р. 1644-8.

7. Sarfraz S. Altered expression of cell cycle and apoptotic proteins in chronic hepatitis C virus infection / S. Sarfraz, S. Hamid, A. Siddiqui et al. // BMC Microbiology. — 2008. — ​Vol. 8. — ​Р. 133.

8. Theocharis S.E. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression in regenerating rat liver after partial hepatectomy / Theocharis S.E., Skopelitou A.S., Margeli A.P. et al. // Dig. Dis. Sci. — 1994 Feb. — ​Vol. 39(2). — ​Р. 245-52.

9. Guarino M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition / M. Guarino, A. Tosoni, M. Nebulini // Hum. Pathol. — 2009. — ​Vol. 40(10). — ​P. 1365-1376.

10. Henderson N.C. Liver fibrosis: cellular mechanisms of progression and resolution / Henderson N.C., Iredale J.P. // Clin. Sci. — 2007. — ​Vol. 112. — ​P. 265-80.

11. Nieto M.A. The SNAIL superfamily of zinc-finger transcription factors / M.A. Nieto // Molecular Сell Biology. — 2002. — ​Vol. 3. — ​P. 155-166.

12. Nieto M.A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives / M.A. Nieto // Int. J. Dev Biol. — 2008. — ​Vol. 52. — ​P. 1-7.

13. Königshoff M. WNT-inducible signaling protein‑1 mediates pulmonary fibrosis in mice and is upregulated in human with idiopathic pulmonary fibrosis / M. Königshoff, M. Kramer, N. Balsara et al. // J. Clin. Invest. — 2009. — ​Vol. 119(4). — ​P. 772-787.


Back to issue