Журнал «Здоровье ребенка» Том 12, №2.1, 2017
Вернуться к номеру
Антагонистические бактерии Bacillus subtilis: влияние на иммунитет и возможности клинического применения
Авторы: Овчаренко Л.С., Вертегел А.А., Слуцкая Т.В., Андриенко Т.Г., Самохин И.В., Кряжев А.В.
ГУ «Запорожская медицинская академия последипломного образования МЗ Украины», г. Запорожье, Украина
Рубрики: Педиатрия/Неонатология
Разделы: Справочник специалиста
Версия для печати
Резюме
Стаття присвячена темі впливу мікрофлори кишечника на розвиток імунної системи організму. Детально описана роль Bacillus subtilis.
Статья посвящена теме влияния микрофлоры кишечника на развитие иммунной системы организма. Подробно описана роль Bacillus subtilis.
The article deals with the influence of intestinal microflora on the development of the immune system of the body. The role of Bacillus subtilis is described in detail.
Ключевые слова
діти; Bacillus subtilis; імунітет; профілактика
дети; Bacillus subtilis; иммунитет; профилактика
children; Bacillus subtilis; immunity; prevention
Иммунная система человека устанавливает баланс между реактивностью и толерантностью в отношении различных инфекционных агентов. Эндогенные и экзогенные сигналы приводят к активации провоспалительных процессов, одновременно запуская механизмы их локализации и угнетения [1].
Онтогенетическое формирование иммунной системы происходило в присутствии большого количества различных микроорганизмов: 1) комменсалов, переданных от генетически близких особей (родителей); 2) непатогенных представителей окружающей среды и 3) возбудителей инфекций, которые могут сосуществовать с макроорганизмом в виде носительства или разной степени выраженности клинических проявлений колонизации [2]. Это позволяет иммунной системе эволюционировать и развиваться на протяжении уже многих миллионов лет [3], воспринимая сигналы как из внешнего мира, так и от собственных клеток, внутри которых могут скрываться ДНК или РНК находившихся там ранее вирусов [4]. Комменсальная микрофлора участвует в развитии многих систем и органов человека — кишечника, костного и головного мозга [5], гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси [6] и непосредственно иммунной системы [3].
После рождения ребенка иммунная система генетически наследует механизмы врожденной защиты, но для полноценного взаимодействия с окружающей средой необходимы процессы распознавания и элиминации микробов, попавших в макроорганизм из внешнего мира. Это обеспечивается реакциями приобретенного (адаптивного) иммунитета, развивающегося в результате контакта с разнообразием микромира [7]. Следует заметить, что высокий защитный фон активации врожденного иммунитета также поддерживается микробными компонентами — пептидогликанами и липополисахаридами кишечной микрофлоры [8], в отношении которой функционируют механизмы иммунной толерантности, предохраняющие от чрезмерной стимуляции иммунитета и развития аутоиммунных процессов [9].
Таким образом, важным аспектом работы иммунной системы является сбалансированность иммунорегуляторных систем активации и супрессии. Физиологически этот баланс обеспечивается микроорганизмами, колонизирующими различные биологические ниши — кишечник, ротоглотку, дыхательные пути, кожу, мочеполовую систему [10].
Микрофлора активно участвует в формировании иммунобиологических реакций организма. Биологически активные вещества (модулины) бактериального происхождения стимулируют синтез иммуноглобулинов, интерферонов, цитокинов, увеличивают количество комплемента, повышают активность лизоцима, стимулируют созревание макрофагально-гистиоцитарной системы, а также оказывают целый ряд других эффектов [11].
Еще нет окончательного понимания механизмов такой иммунорегуляции, вероятно включающей системы дендритных клеток и Treg-лимфоцитов [12]. Но в любом случае в основе иммуноактивных взаимодействий лежит тесная связь между макро- и микромиром, одним из наиболее интересных представителей которого является палочковидная спорообразующая бактерия Bacillus subtilis (сенная палочка) — представитель рода Bacillus из семейства Bacillaceae [13]. Название «сенная палочка» вид получил из-за того, что накопительные культуры этого микроорганизма получали из сенного экстракта.
Bacillus subtilis является продуцентом некоторых полипептидных антибиотиков, а также ферментов (амилазы, протеазы), получаемых промышленно.
Благодаря высоким адаптивным возможностям Bacillus subtilis широко распространены в окружающей среде, и в частности в тех объектах, с которыми человек контактирует наиболее тесно (пищевые продукты, вода, воздух и т.д.). Поэтому бациллы постоянно и в значительных количествах поступают в организм человека и, поскольку являются устойчивыми к ряду пищеварительных ферментов, сохраняют жизнеспособность на всем протяжении желудочно-кишечного тракта.
Благодаря своим свойствам Bacillus subtilis уже более 100 лет привлекает внимание ученых. Так, например, в международной базе данных медицинских и биологических публикаций PubMed содержится более 32 тысяч публикаций, посвященных Bacillus subtilis, при этом с каждым годом их количество возрастает.
Ряд штаммов Bacillus subtilis способны образовывать устойчивые биопленки [14], кислотоустойчивые споры [15] и секретируют мощные противомикробные субстанции (бактериоцины, например субтилизин, кателицидин) для успешного выживания в кишечнике [13, 16], респираторном и урогенитальном тракте [17]. Bacillus subtilis является важным стимулятором для развития лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой оболочкой кишечника, приводя к пролиферации Treg-лимфоцитов [18], модуляции синтеза цитокинов [19] даже в присутствии природных или синтетических антибиотиков [20].
Bacillus subtilis безопасна при употреблении человеком и в настоящее время используется в качестве пробиотика и основы для пищевых добавок [21]. В Украине пробиотики, содержащие различные штаммы Bacillus subtilis, производятся компанией ООО «ФЗ «Биофарма» в виде двух продуктов — Субалин и Биоспорин. Субалин содержит штамм Bacillus subtilis УКМ В-5020 и выпускается для детей младшего возраста в виде флаконов и саше (содержат 1 · 109 микробных клеток), для взрослых и детей старше 12 лет — в виде капсул (содержат 2 · 109 микробных клеток). Эффекты пробиотика Субалин определяются способностью B.subtilis угнетать рост патогенной и условно-патогенной флоры, создавая, таким образом, благоприятные условия для роста представителей нормальной микрофлоры (бифидобактерий, лактобацилл, кишечной палочки). Именно благодаря этому Субалин способствует нормализации качественного и количественного состава микрофлоры кишечника.
Доказанные антагонистические эффекты Bacillus subtilis дополняются выраженным иммунотропным действием, которое доказано в большом количестве современных экспериментальных и клинических научных исследований, существенно расширяющих диапазон показаний для препаратов, содержащих данный микроорганизм в своем составе.
Влияние Bacillus subtilis на врожденный иммунитет
Эффекты Bacillus subtilis в отношении механизмов врожденного иммунитета характеризуются модулирующей направленностью, способной позитивно воздействовать как в условиях недостаточности иммунных стимулов, так и при патологических типах чрезмерной активации иммунной системы различного происхождения.
С одной стороны, Bacillus subtilis стимулируют дендритные клетки для синтеза IL-12, что способствует дифференцировке CD4+ Т-клеток по направлению к Th1-фенотипу, таким образом усиливая противовирусный и противоопухолевый иммунитет. Данный эффект дополняется одновременной активацией естественных киллеров CD16+ с обеспечением достаточной продукции альфа-интерферона и фактора некроза опухоли [22].
Споры Bacillus subtilis обладают высокой адъювантной активностью, индуцируя полноценный иммунный ответ на слизистых оболочках [23]. Вместе с вегетативными клетками Bacillus subtilis они способны стимулировать пролиферацию иммунных клеток в пределах лимфоидной ткани, индуцируя адекватный иммунный ответ и фагоцитоз [24].
С другой стороны, некоторые штаммы Bacillus subtilis обладают высокой антиоксидантной активностью, сдерживающей повреждение ДНК оксидативным стрессом в результате чрезмерной дегрануляции нейтрофилов при воспалительном процессе, что является эффективным инструментом компенсации его негативных последствий и может использоваться у пациентов с рекуррентными, рецидивирующими и хроническими заболеваниями инфекционного или аутоиммунного генеза [17].
Влияние Bacillus subtilis на клеточное звено адаптивного иммунитета
Важной является способность спор Bacillus subtilis вегетировать в просвете желудочно-кишечного тракта и его лимфоидной ткани (в пейеровых бляшках и брыжеечных лимфатических узлах), индуцируя Th1-иммунные реакции, характеризующиеся повышением продукции Т-клеток, синтезирующих ИФН-γ и усиливающих противовирусный иммунитет [25].
Еще одним аспектом иммунотропного эффекта Bacillus subtilis, который заслуживает особого внимания, является индукция ими синтеза цитотоксических Т-лимфоцитов CD8+ и повышение активности этих клеток для противостояния внутриклеточным патогенам и злокачественной пролиферации [26], что создает прекрасные перспективы для профилактики вирусных и онкологических заболеваний.
Влияние Bacillus subtilis на гуморальное звено адаптивного иммунитета
Демонстрируя модулирующий характер своих иммунотропных характеристик, Bacillus subtilis, наряду с активацией клеточного звена адаптивного иммунитета, при пероральном применении вызывают Th2-поляризованные иммунные реакции, которые способствуют продукции В-клеток и антителогенезу [27]. В частности, это касается значительного увеличения концентрации фекальных и слюнных секреторных IgA при применении пробиотиков, содержащих Bacillus subtilis, по сравнению с плацебо [28].
С учетом данной особенности Bacillus subtilis обладают значительным потенциалом для индукции антителоопосредованных иммунных механизмов защиты против инфекционных заболеваний [29].
Влияние Bacillus subtilis на регуляцию синтеза и активности цитокинов
Контакт Bacillus subtilis на индуктивных зонах слизистых оболочек с незрелыми дендритными клетками способствовал их более быстрому созреванию одновременно с повышением продукции IL-6 и ФНО-α CD4+ Т-лимфоцитами по сравнению с Т-клетками, которые были стимулированы антигеном без присутствия Bacillus subtilis [30].
Штаммы Bacillus subtilis стимулируют системную и кишечную продукцию гамма-интерферона, который играет важную роль в защите организма от различных инфекционных заболеваний, в том числе вирусных инфекций, и имеет множество иммунных функций, таких как стимуляция макрофагов и естественных клеток-киллеров [28].
Доказано, что Bacillus subtilis индуцирует секрецию IL-12, IL-2, IL-6, IL-10, гамма-интерферона и фактора некроза опухоли альфа, обеспечивая защиту против множества инфекционных возбудителей [31] и оказывая, таким образом, иммуномодулирующий эффект при различных заболеваниях, в основе патогенеза которых лежит воспалительный процесс.
Перспективы использования иммунотропных свойств Bacillus subtilis при создании новых вакцин
Вышеперечисленные иммунотропные свойства Bacillus subtilis в настоящее время активно используются для создания новых мукозальных и системных вакцин. В них Bacillus subtilis выступает в роли либо адъюванта (усилителя) [32], либо высокоиммуногенного носителя рекомбинантных антигенов [33], безопасного при использовании у людей [29].
При оральном введении вакцины, содержащей Bacillus subtilis вместе с антигенами H.pylori, в слизи желудка значительно увеличивается концентрация секреторного IgA, способствуя подавлению хеликобактерной инфекции. Также при сублингвальном и интраназальном введении вакцины, содержащей Bacillus subtilis и антигены столбнячного токсина, в кишечнике, респираторном и урогенитальном тракте была достигнута высокая иммунопротективная концентрация антигенспецифических IgG и IgA против токсинов столбняка. Подобный эффект был достигнут при введении комбинации Bacillus subtilis с антигенами ротавируса, что послужило основой для создания инновационной модели вакцины против данного возбудителя [27].
Рекомбинантные вакцины, созданные на основе вегетативных клеток и спор Bacillus subtilis, вызывают сбалансированный Th1/Th2 иммунный ответ, усиливая клеточные функции CD4+- и CD8+-лимфоцитов и синтез антигенспецифических IgA и IgG. Эти свойства делают Bacillus subtilis незаменимыми компонентами вакцин в качестве адъювантов [32].
Путем экспериментальных исследований были получены многообещающие результаты создания вакцин-кандидатов на основе Bacillus subtilis для формирования защиты против микобактерий туберкулеза, вируса папилломы человека, вируса ящура [34]. Особый интерес представляет усиление клеточного звена иммунитета при введении Bacillus subtilis, что обеспечивает значительный потенциал для разработки вакцин против многих вирусов (например, ВИЧ, грипп) и других внутриклеточных патогенных микроорганизмов [35].
Влияние Bacillus subtilis на инфекционную заболеваемость детей
Интегральным показателем иммунотропной активности Bacillus subtilis является способность данного микроорганизма при использовании в составе пробиотиков снижать количество инфекционных заболеваний, тяжесть их течения, частоту осложнений либо неудач стандартной терапии. В такой ситуации наиболее актуальным является изучение влияния на заболеваемость детей острой респираторной патологией вегетативных форм или спор Bacillus subtilis, а также возможность их безопасного и эффективного применения для терапии и профилактики данных инфекций.
Начало исследований в данном направлении было положено около 30 лет назад, когда было установлено, что оральное применение пробиотиков, содержащих споры Bacillus subtilis, приводит к снижению частоты респираторных инфекций у детей в возрасте 5–9 лет [36], снижает показатели заболеваемости у детей с частыми повторными острыми заболеваниями верхних дыхательных путей [37], облегчает течение рекуррентных отитов, приводя к более быстрому выздоровлению и снижению числа повторных эпизодов [38].
По данным В.И. Попович (2015), в процессе терапии острого бактериального риносинусита у детей интерферон, который вырабатывают Bacillus subtilis в организме, оказывает антиинфекционное (антибактериальное и противовирусное) действие, способствует повышению эффективности этиотропной терапии, обеспечивая эрадикацию патогенов. Благодаря свойствам Bacillus subtilis в составе пробиотика Субалин, последний способен повышать сопротивляемость организма вирусным инфекциям, что согласуется с рекомендациями Европейского руководства по лечению риносинуситов (редакция 2012 года) с высоким уровнем доказательности. Автор указывает, что такая методология является универсальной и приемлемой для оториноларингологов, педиатров, врачей общей практики — семейной медицины [39].
Применение Bacillus subtilis в составе пробиотика Субалин для комплексного лечения пациентов с паратонзиллитом и паратонзиллярным абсцессом предотвращает развитие антибиотикассоциированной диареи, способствует более быстрому регрессу воспалительного процесса и исчезновению болевого синдрома, а также улучшает качество жизни пациентов [40].
По данным собственных наблюдений, применение Bacillus subtilis в составе пробиотика Субалин у детей в возрасте 2–6 лет с частыми повторными ОРЗ приводило к снижению общего количества (на 47,7 %) респираторной патологии, ее тяжести, частоты развития бактериальных осложнений (на 63,3 %) и необходимости применения антибактериальных средств (на 50,0 %). При применении Субалина случаев нежелательных явлений и побочных реакций зарегистрировано не было, аллергические реакции на прием препарата не наблюдались.
Таким образом, многочисленными исследованиями доказаны иммунотропные свойства бактерии Bacillus subtilis. Важно, что они обладают не только стимулирующим, но и регулирующим потенциалом, способствуя нормализации функционирования механизмов врожденного и адаптивного иммунитета, что установлено современными клиническими исследованиями и может быть использовано для предупреждения развития инфекционных заболеваний. Более того, поликлональная иммунотропная активность Bacillus subtilis позволяет использовать ее у детей раннего возраста без опасности вызвать у них дисбаланс иммунной системы, которая еще находится в стадии формирования.
Возможность применения данной профилактической стратегии у детей обусловлена, кроме ее эффективности, высокой безопасностью и хорошей переносимостью пробиотиков, содержащих в составе Bacillus subtilis, что было неоднократно установлено на примере пробиотика Субалин (ООО «ФЗ «Биофарма», Украина).
Конфликт интересов. Не заявлен.
Список литературы
1. Immune homeostasis, dysbiosis and therapeutic modulation of the gut microbiota / C.T. Peterson, V. Sharma, L. Elmén, S.N. Peterson // Clinical & Experimental Immunology. — 2015. — Vol. 179 (3). — P. 363-377.
2. Rook G.A.W. Microbial Old Friends, immunoregulation and stress resilience / G.A.W. Rook, C.A. Lowry, C.L. Raison // Evol. Med. Public. Health. — 2013. — Vol. 2013 (1). — P. 46-64.
3. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences / M. McFall-Ngai, M.G. Hadfield, T.C. Bosch [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2013. — Vol. 110. — P. 3229-3236.
4. Holmes E.C. The evolution of endogenous viral elements / E.C. Holmes // Cell. Host. Microbe. — 2011. — Vol. 10. — P. 368-377.
5. Normal gut microbiota modulates brain development and behaviour / R.D. Heijtz, S. Wang, F. Anuar [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2011. — Vol. 108. — P. 3047-3052.
6. Exposure to a social stressor alters the structure of the intestinal microbiota: implications for stressor-induced immunomodulation / M.T. Bailey, S.E. Dowd, J.D. Galley [et al.] // Brain. Behav. Immun. — 2011. — Vol. 25. — P. 397-407.
7. Virus-specific DMM. CD4(+) memory-phenotype T cells are abundant in unexposed adults / L.F. Su, B.A. Kidd, A. Han, J.J. Kotzin // Immunity — 2013. — Vol. 38. — P. 373-383.
8. Recognition of peptidoglycan from the microbiota by Nod1 enhances systemic innate immunity / T.B. Clarke, K.M. Davis, E.S. Lysenko [et al.] // Nat. Med. — 2010. — Vol. 16. — P. 228-231.
9. Fleming J.O. Helminth therapy and multiple sclerosis / J.O. Fleming // Int. J. Parasitol. — 2013. — Vol. 43. — P. 259-274.
10. Archaea and fungi of the human gut microbiome: correlations with diet and bacterial residents / C. Hoffmann, S. Dollive, S. Grunberg [et al.] // PLOS ONE. — 2013. — Vol. 8. — P. e66019.
11. Ершова И.Б. Особенности кишечного микробиоценоза при вирусных гепатитах и возможности его коррекции / И.Б. Ершова // Актуальна інфектологія. — 2014. — № 2 (3). — С. 6-10.
12. Induction of colonic regulatory T cells by indigenous clostridium species / K. Atarashi, T. Tanoue, T. Shima [et al.] // Science. — 2011. — Vol. 331. — P. 337-341.
13. Bacillus subtilis isolated from the human gastrointestinal tract / H.A. Hong, E. To, S. Fakhry [et al.] // Res. Microbiol. — 2009. — Vol. 160. — P. 134-143.
14. Identification of Bacillus subtilis SipW as a Bifunctional Signal Peptidase That Controls Surface-Adhered Biofilm Formation / R. Terraa, N.R. Stanley-Walla, G. Caoa, B.A. Lazazzeraa // J. Bacteriol. — 2012. — Vol. 194 (11). — P. 2781-2790.
15. Cutting S.M. Bacillus probiotics / S.M. Cutting // Food. Microbiol. — 2011. — Vol. 28 (2). — P. 214-220.
16. Expressing antimicrobial peptide cathelicidin-BF in Bacillus subtilis using SUMO technology / C. Luan, H.W. Zhang, D.G. Song [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2014. — Vol. 98. — P. 3651-3658.
17. DNA-protection and antioxidant properties of fermentates from Bacillus amyloliquefaciens B-1895 and Bacillus subtilis KATMIRA1933 / E.V. Prazdnova, V.A. Chistyakov, M.N. Churilov [et al.] // Letters in Applied Microbiology. — 2015. — Vol. 61. — P. 549-554.
18. Role of commensal bacteria in development of gut-associated lymphoid tissues and preimmune antibody / K.J. Rhee, P. Sethupathi, A. Driks [et al.] // J. Immunol. — 2004. — Vol. 172. — P. 1118-1124.
19. The Bacillus subtilis quorum-sensing molecule CSF contributes to intestinal homeostasis via OCTN2, a host cell membrane transporter / M. Fujiya, M.W. Musch, Y. Nakagawa [et al.] // Cell. Host. Microbe. — 2007. — Vol. 1 (4). — P. 299-308.
20. Ratna Sudha M. Clinical Study of Bacillus coagulans Unique IS-2 (ATCC PTA-11748) in the Treatment of Patients with Bacterial Vaginosis / M. Ratna Sudha, K.A. Yelikar, S. Deshpande // Indian. J. Microbiol. — 2012. — Vol. 52 (3). — P. 396-399.
21. Minor P.D. Live attenuated vaccines: Historical successes and current challenges / P.D. Minor // Virology. — 2015. — P. 479-480.
22. Immunomodulatory effect of poly-c-glutamic acid derived from Bacillus subtilis on natural killer dendritic cells / S.W. Lee, H.J. Park, S.-H. Park [et al.] // Biochemical and Biophysical Research Communications. — 2014. — Vol. 443. — P. 413-421.
23. Phagocytosis, germination and killing of Bacillus subtilis spores presenting heterologous antigens in human macrophages / M. Ceragioli, G. Cangiano, S. Esin [et al.] // Microbiology. — 2009. — Vol. 155. — P. 338-346.
24. Bacillus subtilis spores expressing the VP28 antigen: a potential oral treatment to protect Litopenaeus vannamei against white spot syndrome / A.T. Nguyen, C.K. Pham, H.T. Pham [et al.] // FEMS Microbiol. Lett. — 2014. — Vol. 358 (2). — P. 202-208.
25. Esparza-Gonzalez S.C. Comparative analysis of Bacillus subtilis spores and monophosphoryl lipid A as adjuvants of protein-based Mycobacterium tuberculosis-based vaccines: partial requirement for interleukin-17a for induction of protective immunity / S.C. Esparza-Gonzalez, A.R. Troy, A.A. Izzo // Clin. Vaccine Immunol. — 2014. — Vol. 21 (4). — P. 501-508.
26. Foged C. License to kill: Formulation requirements for optimal priming of CD8(+) CTL responses with particulate vaccine delivery systems / C. Foged, J. Hansen, E.M. Agger // Eur. J. Pharm. Sci. — 2012. — Vol. 45 (4). — P. 482-491.
27. Immunogenicity of self-adjuvanticity oral vaccine candidate based on use of Bacillus subtilis spore displaying Schistosoma japonicum 26 KDa GST protein / L. Li, X. Hu, Z. Wu [et al.] // Parasitol. Res. — 2009. — Vol. 105 (6). — P. 1643-1651.
28. Probiotic strain Bacillus subtilis CU1 stimulates immune system of elderly during common infectious disease period: a randomized, double-blind placebo-controlled study / M. Lefevre, S.M. Racedo, G. Ri-pert [et al.] // Immunity & Ageing. — 2015. — Vol. 25. — P. 33-38.
29. Rosales-Mendoza S. Bacillus subtilis comes of age as a vaccine production host and delivery vehicle / S. Rosales-Mendoza, C. Angulo // Expert. Rev. — 2015. — P. 1-14.
30. Gram-positive bacteria on grass pollen exhibit adjuvant activity inducing inflammatory T cell responses / B. Heydenreich, I. Bellinghausen, B. König [et al.] // Clinical & Experimental Allergy. — 2012. — Vol. 42 (1). — P. 76-84.
31. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine / M. Song, H.A. Hong, J.M. Huang [et al.] // Vaccine. — 2012. — Vol. 30 (22). — P. 3266-3277.
32. Amuguni H. Bacillus subtilis: a temperature resistant and needle free delivery system of immunogens / H. Amuguni, S. Tzipori // Hum. Vaccin. Immunother. — 2012. — Vol. 8 (7). — P. 979-986.
33. Induction of neutralizing antibodies in mice immunized with an amino-terminal polypeptide of Streptococcus mutans P1 protein produced by a recombinant Bacillus subtilis strain / M.B. Tavares, B.M. Silva, R.C. Cavalcante [et al.] // FEMS Immunol. Med. Microbiol. — 2010. — Vol. 59 (2). — P. 131-142.
34. Buccal and sublingual vaccine delivery / H. Kraan, H. Vrieling, C. Czerkinsky [et al.] // J. Control. Release. — 2014. — Vol. 190. — P. 580-592.
35. Developing plant-based vaccines against neglected tropical diseases: where are we? / S. Rosales-Mendoza, D.O. Govea-Alonso, E. Monreal-Escalante [et al.] // Vaccine. — 2012. — Vol. 31 (1). — P. 40-48.
36. Bacillus subtilis spores as a natural pro-host oral agent. Preliminary data in children / A. Novelli, A. Ulivelli, E.F. Reali [et al.] // Chemioterapia. — 1984. — Vol. 3 (3). — P. 152-155.
37. B. Subtilis spores as a natural pro-host agent in children suffering from recurrent respiratory tract infectious diseases / A. Novelli, A. Ulivelli, E.F. Reali [et al.] // International Journal of Immunopharmacology. — 1985. — Vol. 7 (3). — P. 355.
38. Evaluation of some immunologic parameters in children with recurrent otitis treated with spores of Bacillus subtilis / E. Galli, M. Corgiolu, L. Fiore [et al.] // Clin. Ter. — 1984. — Vol. 109 (4). — P. 329-334.
39. Попович В.И. Роль пробиотиков в оптимизации этиотропной терапии острого бактериального риносинусита / В.И. Попович // Здоровье ребенка. — 2015. — № 1 (60). — С. 49-53.
40. Попович В.І. Роль пробіотиків в оптимізації етіотропної терапії гострого паратонзиліту / В.І. Попович // Здоровье ребенка. — 2016. — № 7. — С. 49-53.