Журнал "Здоров`я дитини" 6(15) 2008
Повернутися до номеру
Антиэндотоксиновый иммунитет у детей с гнойно-деструктивными пневмониями с учетом тинкториальных свойств возбудителя на этапе госпитализации
Автори: Л.Ф. Притуло, Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского, г. Симферополь
Рубрики: Педіатрія/Неонатологія
Версія для друку
Для изучения антиэндотоксинового иммунитета при острой гнойно-деструктивной пневмонии проведено исследование у 220 детей: у 140 (64 %) была легочная форма пневмонии, у 80 (36 %) — легочно-плевральная.
Гнойно-деструктивная пневмония у детей вызывает дисбаланс системы антиэндотоксинового иммунитета, который характеризуется снижением анти-ЭТ-IgG и гиперэкспрессией анти-ЭТ-IgМ, LBP и sCD14. Установлено, что для грамотрицательной флоры уровень анти-ЭТ-IgМ, LBP и sCD14 самый высокий в сравнении с грамположительной и смешанной инфекцией.
антиэндотоксиновый иммунитет, гнойно-деструктивная пневмония, дети.
Ранняя диагностика осложнений у детей с гнойно-деструктивными формами острой пневмонии остается актуальной проблемой детской хирургии в связи с широкой распространенностью заболевания, многообразием клинико-рентгенологических проявлений, тяжелым течением процесса и сохраняющейся летальностью [1].
Несмотря на снижение летальности от пневмонии за последние 50 лет на 97 %, в США и Европе она встречается с частотой от 34 до 40 случаев на 1000 детей [2].
В последнее время особое внимание уделяется пневмониям, вызываемым грамотрицательной микрофлорой, которые характеризуются ранним появлением тяжелых осложнений и неблагоприятным прогнозом [3].
Среди возбудителей внегоспитальной пневмонии грамотрицательные микроорганизмы составляют 45,4 %. В ассоциациях бактерии этой группы встречаются в 65,1 % случаев пневмоний средней степени тяжести и в 69,2 % — с тяжелым течением [3].
Считается, что именно эндотоксин (ЭТ) грамотрицательных инфекций играет одну из ведущих ролей в формировании синдрома эндогенной интоксикации. Он обладает исключительно высокой биологической активностью и относится к числу наиболее сильных экзогенных модуляторов иммунологической реактивности. Основное патофизиологическое действие ЭТ опосредуется индукцией выброса целого ряда эндогенных медиаторов воспаления, синтезируемых в основном клетками миеломоноцитарного ряда [4].
Сеть цитокинов и воспалительных молекул передает сигналы между нейтрофилами, моноцитами, макрофагами и эндотелиальными клетками. Аутокринная и паракринная активация приводит к синергизму потенцирования воспалительного ответа, если он активируется системной эндотоксинемией. В основном патологический процесс локализуется в первичном очаге инфекции (легкие). Если происходит генерализация воспалительного процесса, то это неизбежно приводит к повреждению сосудов, активации свертывающей системы и в конечном итоге — к септическому шоку [4].
Так, происходит связывание эндотоксина с плазменным белком (Lipopolysaccharide Binding Protein — LBP), который обладает высоким аффинитетом к липиду А и опосредует взаимодействие эндотоксина с мембраносвязывающим рецептором CD14 и TLR4 (toll-like receptor 4) на клетках моноцитарно-макрофагального ряда и потенцирует выработку этими клетками провоспалительных цитокинов [5, 6].
LBP имеет массу 60 kDa и связывает липиды/фосфолипиды, а также протеины с довольно широкой специфичностью. Его первичной ролью в отношении эндотоксина, как полагают, является связывание мономеров эндотоксина от бактериальной мембраны или от скопления циркулирующего эндотоксина, с последующим взаимодействием с CD14, которое приводит к целевой клеточной активации [7, 8].
Во многих исследованиях показано, что эндотелиальные клетки испытывают недостаток в mCD14 и отвечают на эндотоксин прежде всего через растворимую форму (sCD14) этого рецептора [9].
Таким образом, к гуморальным, неспецифическим механизмам индукции антиэндотоксинового иммунитета можно отнести LBP и sCD14.
К гуморальным механизмам деактивации эндотоксина можно отнести естественные антиэндотоксиновые антитела. Известно, что важную роль в клиренсе липополисахарида (ЛПС) как непосредственно в слизистых, так и в кровотоке играют антиэндотоксиновые антитела [10]. Более того, антитела к консервативным частям молекулы ЭТ можно рассматривать как универсальный интегральный маркер, одновременно отражающий реакцию организма на поступление ЭТ и характеризующий врожденный и приобретенный иммунитет к грамотрицательным микроорганизмам [11, 12].
Эндотоксин может вызывать или ускорять иммунное воспаление через множественные механизмы, которые приводят к гиперэкспрессии реактивных форм кислорода, хемотаксических и провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1, IL-8) и других острофазовых реагентов, в частности С-реактивного белка, молекул адгезии, а также к дисрегуляции рецепторных структур [6].
В наших предыдущих работах было показано, что у детей с гнойно-деструктивной пневмонией при грамотрицательной флоре наблюдается гуморальный иммунодефицит, который ассоциируется с угнетением цитокинов Т-хелперов 2-го типа (гуморальный цитокиновый профиль) и гиперсекрецией провоспалительных медиаторов. Очевидно, что такие результаты могут быть связаны с состоянием антиэндотоксинового иммунитета у данной категории больных.
В связи с этим целью нашей работы стало изучение показателей антиэндотоксинового иммунитета у больных с гнойно-деструктивными пневмониями в зависимости от формы пневмонии, типов инфекционных агентов на этапе госпитализации.
Материалы и методы
Для изучения антиэндотоксинового иммунитета при острой гнойно-деструктивной пневмонии (ОГДП) проведено исследование у 220 детей, госпитализированных в хирургическое отделение Республиканской детской клинической больницы г. Симферополя.
Из 220 больных с ОГДП у 140 (64 %) была легочная форма пневмонии, у 80 (36 %) — легочно-плевральная. Возраст больных составлял от 1 года до 14 лет.
В зависимости от тинкториальных свойств возбудителя пациенты были разделены на 3 субгруппы: с грамотрицательной, грамположительной и смешанной флорой.
Контрольную группу составили 110 условно здоровых детей того же возраста.
Количество мальчиков, девочек и их возраст в исследуемых группах статистически не отличались.
Диагноз ОГДП устанавливался на основании клинических, рентгенологических и лабораторных данных.
Уровни антиэндотоксиновых антител классов А, М, G (соответственно анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM и анти-ЭТ-IgG) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа [13, 14]. В качестве антигена использовали ЛПС грамотрицательной энтеробактерии Escherichia coli K30 (O9:K30:H12), выделенной из бактериальной биомассы методом водно-фенольной экстракции и дополнительно очищенной от примесей РНК обработкой цетавлоном (Serva, Германия). Уровни анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM и анти-ЭТ-IgG выражали в условных единицах оптической плотности конечного продукта ферментативной реакции для разведения тестируемой сыворотки крови 1 : 50 (для анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM) и 1 : 200 (для анти-ЭТ-IgG).
Для исследования LBP и sCD14 использовали тест-системы «Hbt Human LBP ELISA Kit, Product Number: HK315» и «Hbt Human sCD14 ELISA Kit, Product Number: HK320» производства Hycult biotechnology, Голландия. Образцы и стандартные растворы инкубировали в титрационном микропланшете, покрытом антителами к LBP или sCD14. Во время инкубации LBP или sCD14 связывались с антителами, не связанный материал извлекался вымыванием. Биотинилированные вторые антитела к LBP или sCD14 добавлялись в микропланшеты, после чего проводили вторичную отмывку. Стрептавидин-пероксидазный конъюгат добавляли в образцы, после чего остаток удаляли повторным вымыванием, останавливали реакцию добавлением лимонной кислоты. Оптическую плотность определяли на анализаторе StatFox 2100 на длине волны 450 нм [15]. Содержание LBP и sCD14 выражали в мкг/мл.
Все полученные результаты подвергнуты статистической обработке для параметрических и непараметрических критериев с использованием программы MedStat (серийный № MS0011) ДНПП ООО «Альфа», г. Донецк.
При анализе для проверки распределения на нормальность использовали хи-квадрат и критерий W Шапиро — Уилка, сравнение центральных тенденций двух независимых выборок с использованием W-критерия Вилкоксона и сравнение средних двух независимых выборок по критерию Стьюдента. Для множественного сравнения непараметрических данных использовали ранговый однофакторный анализ Крускала — Уоллиса и критерий Данна [16].
Результаты и их обсуждение
В нашей работе для полной оценки состояния антиэндотоксинового иммунитета изучали специфические (анти-ЭТ-IgA, -IgM, -IgG — приобретенный иммунитет) и неспецифические (LBP, sCD14 — врожденный иммунитет) показатели. Показатели антиэндотоксинового иммунитета представлены в табл. 1.
Статистический анализ данных табл. 1 выявил следующие закономерности. Уровень анти-ЭТ-IgG при легочной и легочно-плевральной форме был достоверно ниже (Р < 0,01) по сравнению с контролем. Кроме того, значения анти-ЭТ-IgG достоверно не отличались (Р > 0,05) между группами с легочной и легочно-плевральной формами ОГДП. В свою очередь, уровень анти-ЭТ-IgМ был достоверно выше (Р < 0,01) контроля, но его значения не отличались (Р > 0,05) между формами пневмонии. В отношении анти-ЭТ-IgА наблюдалась совершенно другая динамика: уровень этого антитела был достоверно выше (Р < 0,01) при легочно-плевральной форме по сравнению с контролем и легочной формой, а самые низкие значения анти-ЭТ-IgА были зафиксированы для легочной формы.
При анализе неспецифических показателей LBP и sCD14 (табл. 1) были получены следующие результаты: уровни LBP и sCD14 у детей с ОГДП были значительно выше (Р < 0,01) контроля.
Таким образом, анализ состояния антиэндотоксинового иммунитета показал, что гнойно-деструктивная пневмония у детей вызывает дисбаланс в системе специфического (снижение анти-ЭТ-IgG) и неспецифического (гиперэкспрессия LBP и sCD14) звена. Очевидно, что полученные результаты связаны с этиологией инфекционных возбудителей, характеристикой которых в ассоциации с показателями антиэндотоксинового иммунитета можно объяснить дисбаланс иммунного ответа.
Показатели антиэндотоксинового иммунитета в зависимости от тинкториальных свойств возбудителя представлены в табл. 2.
Уровень анти-ЭТ-IgG (табл. 2) был достоверно ниже (Р < 0,01) во всех субгруппах с легочной и легочно-плевральной формой ОГДП по сравнению с показателями контрольной группы. При сравнении соответствующих субгрупп с легочной и легочно-плевральной формой были получены следующие результаты: уровень анти-ЭТ-IgG грамотрицательной флоры легочно-плевральной формы был достоверно выше (Р < 0,01) значений аналогичной субгруппы легочной формы, а содержание анти-ЭТ-IgG в грамположительной субгруппе было выше (Р < 0,05) для легочной формы.
В отношении анти-ЭТ-IgМ (табл. 2) наблюдалась следующая картина: уровень анти-ЭТ-IgМ был достоверно выше (Р < 0,05) во всех субгруппах легочной и легочно-плевральной формы по сравнению с контролем; в свою очередь, содержание этого антитела было самое высокое (Р < 0,01) в грамотрицательной субгруппе по сравнению с грамположительной и смешанной как для легочной, так и для легочно-плевральной формы. Что касается легочно-плевральной формы, то уровень анти-ЭТ-IgМ был достоверно выше (Р < 0,05) по сравнению с легочной при парном сравнении соответствующих субгрупп.
Статистический анализ для анти-ЭТ-IgА (табл. 2) подтвердил основные закономерности, установленные нами на предыдущем этапе (табл. 1). При легочно-плевральной форме уровень анти-ЭТ-IgА был достоверно выше (Р < 0,01) во всех субгруппах, а при легочной — достоверно ниже (Р < 0,01) по сравнению с контролем.
Уровни LBP и sCD14 (табл. 2) были достоверно выше (Р < 0,01) во всех субгруппах легочной и легочно-плевральной формы по сравнению с контролем. Самые высокие значения LBP и sCD14 были зафиксированы в грамотрицательной субгруппе легочной и легочно-плевральной формы. Значения sCD14 при сравнении между формами были достоверно выше (Р < 0,05) во всех субгруппах легочной формы по сравнению с соответствующими субгруппами легочно-плевральной формы, а для LBP — аналогично, только в грамотрицательной субгруппе.
Таким образом, на данном этапе анализа мы полностью охватили спектр поставленных задач, что позволило нам перейти к обсуждению результатов.
Показано, что именно антиэндотоксиновые антитела класса M и G обладают максимальной эндотоксиннейтрализующей активностью. От формирования антиэндотоксиновых антител, относящихся к иммуноглобулину А, зависит формирование антигенспецифического секреторного иммуноглобулина А [17]. Антительный механизм нейтрализации эндотоксина является наиболее физиологичным.
Анализ специфического адаптивного антиэндотоксинового иммунитета в нашей работе показал, что гнойно-деструктивная пневмония у детей на 1-е сутки госпитализации приводит к дисбалансу антительных механизмов иммунного ответа на эндотоксин, который манифестируется значительным снижением антиэндотоксиновых антител класса G, с одной стороны, и высокими уровнями анти-ЭТ-IgM — с другой. Очевидно, что полученные результаты связаны в первую очередь с тем, что чрезмерное поступление эндотоксина может индуцировать активацию специфических В-лимфоцитов с последующим массивным выделением низкоаффинных антител класса M, а для переключения синтеза высокоаффинных антител G требуется значительный интервал времени. При легочно-плевральной форме пневмонии высокие уровни анти-ЭТ-IgА связаны с тем, что данная форма ассоциируется с эпителиальным иммунитетом плевры, а гуморальные анти-ЭТ-IgА служат основой для формирования эндотоксинспецифического секреторного иммуноглобулина А.
Известно, что различные типы инфекционных возбудителей связаны с антиэндотоксиновым иммунитетом напрямую, если возбудителем пневмонии является грамотрицательная или смешанная флора, и косвенно — при грамположительной, когда источником эндотоксина является E.coli кишечника [18].
По результатам нашей работы, антиэндотоксиновый иммунитет при грамотрицательной флоре характеризуется тем, что значения анти-ЭТ-IgG и анти-ЭТ-IgМ выше по сравнению с показателями грамположительной и смешанной субгрупп.
При дисфункции приобретенного антиэндотоксинового гуморального иммунитета нейтрализация эндотоксина, закономерно поступающего в портальный кровоток, может осуществляться другими эндотоксинсвязывающими механизмами [19].
У пациентов с хроническими инфекциями повышение уровня sCD14 коррелирует с увеличенной летальностью при бактериемии [20]. При острой воспалительной реакции уровень sCD14 и LBP увеличивается в несколько раз [21]. Повышенное соотношение LBP/sCD14, связанное с острофазовой реакцией, как полагают, играет роль в усилении эндотоксинзависимой воспалительной реакции путем увеличения уровня регулирования клеточной активации и угнетения клиренса эндотоксина [22, 23]. Интраперитонеальная инъекция LBP мышам, инфицированным ЛПС, приводит к увеличению летальности [24].
При анализе неспецифического врожденного антиэндотоксинового иммунитета нами установлено, что показатели LBP и sCD14 достоверно выше во всех субгруппах легочной и легочно-плевральной формы по сравнению с контролем. Самые высокие значения LBP и sCD14 характерны для грамотрицательной флоры.
Таким образом, гнойно-деструктивная пневмония у детей вызывает дисбаланс в системе антиэндотоксинового иммунитета, который характеризуется снижением анти-ЭТ-IgG и гиперэкспрессией анти-ЭТ-IgМ, LBP и sCD14.
Выводы
1. У детей с гнойно-деструктивной пневмонией наблюдается дисбаланс антиэндотоксинового иммунитета: уровни анти-ЭТ-IgG при легочной и легочно-плевральной форме ОГДП достоверно ниже (Р < 0,01) по сравнению с контролем и достоверно не отличаются (Р > 0,05) при легочной и легочно-плевральной форме; уровень анти-ЭТ-IgМ достоверно выше (Р < 0,01) контроля и не отличается (Р > 0,05) при разных формах пневмонии; анти-ЭТ-IgА достоверно выше (Р < 0,01) при легочно-плевральной форме по сравнению с контролем и легочной формой; уровни LBP и sCD14 значительно выше (Р < 0,01) контроля.
2. В зависимости от тинкториальных свойств возбудителя антиэндотоксиновый иммунитет характеризуется следующими изменениями: уровень анти-ЭТ-IgG грамотрицательной флоры при легочно-плевральной форме достоверно выше (Р < 0,01) значений аналогичной субгруппы легочной формы, а содержание анти-ЭТ-IgG в грамположительной субгруппе выше (Р < 0,05) при легочной форме; уровень анти-ЭТ-IgМ самый высокий (Р < 0,01) в грамотрицательной субгруппе по сравнению с грамположительной и смешанной как для легочной, так и для легочно-плевральной формы; значения LBP и sCD14 самые высокие в грамотрицательной субгруппе легочной и легочно-плевральной формы.
Перспективы дальнейших исследований. С учетом полученных данных о роли антиэндотоксинового иммунитета у больных с гнойно-деструктивной пневмонией планируется изучение иммунокоррекции у данной категории пациентов в зависимости от стадийности септического процесса и патогенетических механизмов ответа организма на эндотоксин грамотрицательной флоры.
1. Баиров Г.А. Срочная хирургия детей. Руководство для врачей. — СПб., 1997. — 462 с.
2. Белоглазов В.А. Выявление у больных бронхиальной астмой в системном кровотоке и мокроте комплексов, состоящих из эндотоксина грамм-негативной флоры кишечника и фибронектина // Імунологія та алергологія. — 1998. — № 1-2. — С. 131-137.
3. Белоглазов В.А., Прохоров Д.В., Притуло О.А., Гордиенко А.И. Изучение содержания антител к эндотоксинам у больных микробной экземой // Український журнал дерматології, венерології, косметології. — 2002. — № 3(6). — С. 22-24.
4. Гордиенко А.И., Белоглазов В.А., Гордиенко А.И. Микротурбидиметрический метод определения IgG, IgM, IgA человека // Iмунологiя та алергологiя. — 2000. — № 1. — С. 12-15.
5. Гордієнко А.І., Білоглазов В.О. Патент 70193 А Україна, МКІ 7 А61К31/01. Спосіб визначення антитіл до діполісахаридів грамнегативних бактерій; Заявл. 29.12.2003; Опубл. 15.09.2004, бюл. № 9.
6. Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях. — К.: Морион, 2000. — 319 с.
7. Миронов П.И., Мардганиева Э.А., Макушкин В.В. Тяжелая внебольничная пневмония у детей // Вестник интенсивной терапии. — 2004. — № 4, приложение. — С. 34-35.
8. Острые пневмонии у детей / Под ред. В.К. Таточенко. — Чебоксары: Изд-во Чувашского ун-та, 1994. — 653 c.
9. Уровни естественных антител к липополисахаридам энтеробактерий у постоянных доноров республики Крым / Гордиенко А.И., Бакова А.А., Химич Н.В., Белоглазов В.А. // Імунологія та алергологія. — 2003. — № 4. — С. 31-36.
10. Bierhaus A., Chen J., Liliensiek B., Nawroth P.P. LPS and cytokine-activated endothelium // Semin. Thromb. Hemost. — 2000. — 26, № 5. — P. 571-587.
11. Carrillo E.H., Gordon L., Goode E., Davis E., Polk H.C. Jr. Early elevation of soluble CD14 may help identify trauma patients at high risk for infection // J. Trauma. — 2001. — Vol. 50(5). — P. 810-12.
12. Chen G., Li J., Ochani M., Rendon-Mitchell B., Qiang X. et al Bacterial endotoxin stimulates macrophages to release HMGB1 partly through CD14- and TNF-dependent mechanisms // J. Leukoc. Biol. — 2004. — Vol. 76, № 5. — P. 994-1001.
13. Down J.F., Barclay G.R., Bennett-Guerrero E., Hamilton-Davies C. et al. A descriptive study of the variation in baseline levels of antiendotoxin core antibodies between US and UK populations // J. Endotoxin Res. — 2004. — Vol.10, № 3. — P. 195-198.
14. Frey E.A., Miller D.S., Jahr T.G., Sundan A., Bazil V., Espevik T., Finlay B.B., Wright S.D. Soluble CD14 participates in the response of cells to lipopolysaccharide // J. Exp. Med. — 1992. — Vol. 176. — P. 1665-1671.
15. Gioannini T.L., Teghanemt A., Zarember K.A., Weiss J.P. Regulation of interactions of endotoxin with host cells // J. Endotoxin Res. — 2003. — Vol. 9, № 6. — P. 401-408.
16. Heumann D., Lauener R., Ryffel B. The dual role of LBP and CD14 in response to Gram-negative bacteria or Gram-negative compounds // J. Endotoxin Res. — 2003. — Vol. 9(6). — P. 381-4.
17. Kato A., Ogasawara T., Homma T., Saito H., Matsumoto K. Lipopolysaccharide-binding protein critically regulates lipopolysaccharide-induced IFN-beta signaling pathway in human monocytes // J. Immunol. — 2004. — Vol. 172(10). — P. 6185-94.
18. Lamping N., Dettmer R. , Schroder N.W.J., Pfeil D., Hallatschek W., Burger R. LPS-binding protein protects mice from septic shock caused by LPS or Gram-negative bacteria // J. Clin. Invest. — 1998. — Vol. 101. — P. 2065-2071.
19. Landmann R., Zimmerli W., Sansano S., Link S., Hahn A., Glauser M.P., Calandra T. Increased circulating soluble CD14 is associated with high mortality in gram-negative shock // J. Infect. Dis. — 1995. — Vol. 171. — P. 639-644.
20. Tiirola T., Jaakkola A., Bloigu A., Paldanius M., Sinisalo J., Nieminen M.S., Silvennoinen-Kassinen S., Saikku P., Jauhiainen M., Leinonen M. Novel enzyme immunoassay utilizing lipopolysaccharide-binding protein as a capture molecule for the measurement of chlamydial lipopolysaccharide in serum // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. — 2006. — Vol. 54(1). — P. 7-12.
21. Van Bossuyt H., De Zanger R.B., Wisse E. Cellular and subcellular distribution of injected lipopolysaccharide in rat liver and its inactivation by bile salts // J. Hepatol. — 1988. — Vol. 7. — P. 325-337.
22. Veszelka S., Pasztoi M., Farkas A.E., Krizbai I., Dung N.T., Niwa M., Abraham C.S., Deli M.A. Pentosan polysulfate protects brain endothelial cells against bacterial lipopolysaccharide-induced damages // Neurochem. Int. — 2007. — Vol. 50. — P. 219-28.
23. Weiss J. Bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) and lipopolysaccharide-binding protein (LBP): structure, function and regulation in host defence against Gram-negative bacteria // Biochem. Soc. Trans. — 2003. — Vol. 31(Pt. 4). — P. 785-90.
24. Zapata-Quintanilla L.B., Palmeira P., Tino-De-Franco M., Amaral J.A., Carbonare C.B., Carbonare S.B. Systemic antibody response to diarrheagenic Escherichia coli and LPS O111, O157 and O55 in healthy Brazilian adults // Scand. J. Immunol. — 2006. — Vol. 64(6). — P. 661.