Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.



СІМЕЙНІ ЛІКАРІ ТА ТЕРАПЕВТИ
день перший
день другий

АКУШЕРИ ГІНЕКОЛОГИ

КАРДІОЛОГИ, СІМЕЙНІ ЛІКАРІ, РЕВМАТОЛОГИ, НЕВРОЛОГИ, ЕНДОКРИНОЛОГИ

СТОМАТОЛОГИ

ІНФЕКЦІОНІСТИ, СІМЕЙНІ ЛІКАРІ, ПЕДІАТРИ, ГАСТРОЕНТЕРОЛОГИ, ГЕПАТОЛОГИ
день перший
день другий

ТРАВМАТОЛОГИ

ОНКОЛОГИ, (ОНКО-ГЕМАТОЛОГИ, ХІМІОТЕРАПЕВТИ, МАМОЛОГИ, ОНКО-ХІРУРГИ)

ЕНДОКРИНОЛОГИ, СІМЕЙНІ ЛІКАРІ, ПЕДІАТРИ, КАРДІОЛОГИ ТА ІНШІ СПЕЦІАЛІСТИ

ПЕДІАТРИ ТА СІМЕЙНІ ЛІКАРІ

АНЕСТЕЗІОЛОГИ, ХІРУРГИ

"Child`s Health" 3(18) 2009

Back to issue

Антиэндотоксиновый иммунитет у детей с перитонитом с учетом тинкториальных свойств возбудителя на этапе госпитализации

Authors: Кривченя Д.Ю., Мальцев В.Н., Ковалев В.А., Притуло Л.Ф. Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского, г. Симферополь

Categories: Pediatrics/Neonatology

print version


Summary

Для изучения антиэндотоксинового иммунитета при перитоните проведено исследование у 114 детей. Перитонит приводит к дисрегуляции в системе антиэндотоксинового иммунитета, которая проявляется в угнетении специфического звена (резкое снижение высокоаффинных анти-ЭT-IgG) и активации неспецифических компонентов (повышение уровня LBP и sCD14) с наибольшей степенью выраженности для разлитой формы перитонита. Установленная зависимость тяжести перитонита от степени дисрегуляции антиэндотоксинового иммунитета наиболее характерна для грамотрицательной флоры, при которой наблюдается резкое снижение анти-ЭT-IgG и повышение анти-ЭT-IgM, анти-ЭT-IgF, LBP и sCD14 в сравнении с грамположительной и смешанной инфекцией.


Keywords

перитонит у детей, антиэндотоксиновый иммунитет.

Распространенность перитонита в детском возрасте составляет в настоящее время от 1 до 2,5 % среди всех случаев «острого живота», требующих хирургического вмешательства [1, 2].
Значительное количество осложнений и летальных исходов при перитоните возникает как следствие многообразных патогенетических механизмов, задействованных при данном заболевании, многие из которых на сегодняшний день изучены недостаточно [1]. Представления о ведущих механизмах перитонита с течением времени претерпели определенную трансформацию [2]. В настоящее время проблема перитонита все больше рассматривается как проблема воспаления [3].
В наших предыдущих работах было показано, что при перитоните у детей наблюдается гиперсекреция провоспалительных медиаторов в брюшной полости, что связано с дисбалансом в системе цитокиновой регуляции Т-хелперов 1-го, 2-го типов, который проявляется гиперсекрецией цитокинов клеточного профиля (ИЛ-2, ИФ-g) и снижением гуморального (ИЛ-4, ИЛ-10). Грамотрицательная инфекция по сравнению с грамположительной и смешанной при перитоните ассоциируется с более выраженной секрецией провоспалительных медиаторов, которая связана с преобладанием цитокинов клеточного профиля.
Считается, что именно эндотоксин (ЭТ) грамотрицательных инфекций играет одну из ведущих ролей в формировании синдрома эндогенной интоксикации. Он обладает исключительно высокой биологической активностью и относится к числу наиболее сильных экзогенных модуляторов иммунологической реактивности. Основное патофизиологическое действие ЭТ опосредуется индукцией выброса целого ряда эндогенных медиаторов воспаления, синтезируемых в основном клетками миеломоноцитарного ряда [4].
Эндотоксин связывается с плазменным белком (Lipopolysaccharide Binding Protein — LBP), который обладает высоким аффинитетом к липиду А и опосредует взаимодействие эндотоксина с мембраносвязывающими рецепторами CD14 и TLR4 (toll-like receptor 4) на клетках моноцитарно-макрофагального ряда, потенцирует выработку этими клетками провоспалительных цитокинов [5, 6]. LBP имеет массу 60 kDa и связывает липиды/фосфолипиды, а также протеины с довольно широкой специфичностью. Его первичная роль по отношению к эндотоксину заключается в связывании последнего от бактериальной мембраны или от скопления циркулирующего эндотоксина, с последующим взаимодействием с CD14, которое приводит к целевой клеточной активации [7, 8].
К гуморальным, неспецифическим механизмам индукции антиэндотоксинового иммунитета можно отнести LBP и sCD14, а деактивация эндотоксина осуществляется естественными антиэндотоксиновыми антителами.
В связи с этим целью данной работы стало изучение показателей специфического и неспецифического антиэндотоксинового иммунитета у детей с различными формами перитонита с учетом тинкториальных свойств возбудителя на этапе госпитализации.

Материалы и методы
Для изучения антиэндотоксинового иммунитета при перитоните проведено исследование у 114 детей, госпитализированных в хирургическое отделение Республиканской детской клинической больницы г. Симферополя.
Согласно классификации В.К. Гостищева (1992) у больных имел место местный перитонит — 70 (61,4 %) случаев, диффузный — 28 (24,56 %) и разлитой — 16 детей (14,03 %). Возраст больных колебался от 1 года до 14 лет.
В зависимости от тинкториальных свойств возбудителя пациенты были разделены на 3 субгруппы: с грамотрицательной, грамположительной и смешанной флорой.
Контрольную группу составили 110 условно здоровых детей того же возраста.
Количество мальчиков, девочек и возраст в исследуемых группах статистически не отличались.
Уровни антиэндотоксиновых антител классов А, М, G (соответственно анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM и анти-ЭТ-IgG) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа [9, 10]. В качестве антигена использовали липополисахарид грамотрицательной энтеробактерии Escherichiacoli K30 (O9:K30:H12), выделенный из бактериальной биомассы методом водно-фенольной экстракции и дополнительно очищенный от примесей РНК обработкой цетавлоном (Serva, Германия). Уровни анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM и анти-ЭТ-IgG выражали в условных единицах оптической плотности конечного продукта ферментативной реакции для разведения тестируемой сыворотки крови 1 : 50 (для анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM) и 1 : 200 (для анти-ЭТ-IgG).
Для исследования LBP и sCD14 использовали тест-системы «Hbt Human LBP ELISA Kit, Product Number: HK315» и «Hbt Human sCD14 ELISA Kit, Product Number:
HK320» производства Hycult biotechnology (Голландия). Образцы и стандартные растворы инкубировали в титрационных микропланшетах, покрытых антителами к LBP или sCD14. Во время инкубации LBP или sCD14 связывались с антителами, несвязанный материал извлекался вымыванием. Биотинилированные вторые антитела к LBP или sCD14 добавлялись в микропланшеты, после чего проводили вторичную отмывку. Стрептавидин-пероксидазный конъюгат добавляли в образцы, после чего остаток удаляли повторным вымыванием, останавливали реакцию добавлением лимонной кислоты. Оптическую плотность определяли на анализаторе StatFox 2100 на длине волны 450 нм [11]. Содержание LBP и sCD14 выражали в мкг/мл.
Все полученные результаты подвергнуты статистической обработке для параметрических и непараметрических критериев с использованием программы MedStat (серийный номер MS0011) ДНПП ООО «Альфа», г. Донецк.
При анализе для проверки распределения на нормальность использовали Хи-квадрат и критерий W Шапиро — Уилка, сравнение центральных тенденций двух независимых выборок проводили с использованием W-критерия Вилкоксона, сравнение средних двух независимых выборок — по критерию Стьюдента. Для множественного сравнения использовали ранговый однофакторный анализ Крускала — Уоллиса и критерий Данна [12].

Результаты и их обсуждение
Вначале статистическому анализу были подвергнуты показатели антиэндотоксинового иммунитета у детей с различными формами перитонита на 1-е сутки госпитализации (табл. 1).
При анализе данных табл. 1 было выявлено, что уровень анти-ЭТ-IgG был достоверно снижен (Р < 0,01) при всех формах перитонита по сравнению с показателями контрольной группы. При множественном анализе форм перитонита было выявлено, что самые низкие значения анти-ЭТ-IgG зафиксированы для разлитой формы по сравнению с диффузной и местной (Р < 0,01). В свою очередь, уровни анти-ЭТ-IgМ и анти-ЭТ-IgА были достоверно выше контроля (Р < 0,01) при всех формах перитонита, при этом при разлитой и диффузной формах увеличение концентрации анти-ЭТ-IgА было достоверно выше (Р < 0,01), чем при местной.
Показатели неспецифического антиэндотоксинового иммунитета (LBP и sCD14) были статистически значимо повышены (Р < 0,01) при всех формах перитонита. Для показателя sCD14 было установлено, что его повышение при разлитой и диффузной формах было достоверно выше (Р < 0,01), чем при местной.


Таким образом, анализ табл. 1 свидетельствует о том, что перитонит у детей приводит к дисрегуляции в системе антиэндотоксинового иммунитета, которая проявляется в угнетении специфического звена (резкое снижение высокоаффинных анти-ЭТ-IgG) и активации неспецифических компонентов (повышение уровня LBP и sCD14). Данные изменения наиболее характерны для разлитой формы перитонита.
На данном этапе работы мы раскрыли основные механизмы иммунного ответа на эндотоксин в зависимости от формы (тяжести) перитонита, что позволило нам перейти к анализу полученных результатов в зависимости от типа возбудителя в контексте изучаемой проблемы (табл. 2).


Данные, представленные в табл. 2, характеризуют показатели антиэндотоксинового иммунитета у детей с различными формами перитонита на 1-е сутки госпитализации в зависимости от типа возбудителя. Их анализ позволил установить, что для анти-ЭТ-IgG характерно снижение концентрации в грамотрицательной субгруппе разлитой формы, грамотрицательной и смешанной субгруппах диффузной формы и грамотрицательной субгруппе местной формы (Р < 0,01). Кроме того, во всех формах грамотрицательных субгрупп уровень анти-ЭТ-IgG был достоверно ниже, чем в остальных субгруппах в пределах каждой формы (Р < 0,01).
Межсубгрупповой анализ для анти-ЭТ-IgG (табл. 2) позволил установить различие между грамотрицательными субгруппами разлитой и местной форм (Р < 0,01), а также разлитой и диффузной (Р < 0,01). Самые низкие значения анти-ЭТ-IgG были зафиксированы для разлитой формы грамотрицательной субгруппы.
Установление отличия показателей анти-ЭТ-IgM (табл. 2) опытных субгрупп от контроля позволило выявить следующие закономерности: повышение содержания анти-ЭТ-IgM в субгруппах с грамотрицательной флорой при всех формах и в субгруппе со смешанной флорой при диффузной форме (Р < 0,01). При этом в грамотрицательных субгруппах разлитой и местной форм было достоверное (Р < 0,01) повышение уровня анти-ЭТ-IgM по сравнению с другими субгруппами.
Межсубгрупповой анализ для анти-ЭТ-IgM достоверных отличий не выявил (Р>0,05).
Уровень анти-ЭТ-IgA (табл. 2) был достоверно выше контроля во всех субгруппах (Р < 0,01) за исключением грамположительной при местной форме. При местной форме грамотрицательной субгруппы уровень анти-ЭТ-IgA был достоверно выше, чем в других субгруппах той же формы (Р < 0,01).
Межсубгрупповой анализ показал отличие концентрации анти-ЭТ-IgA на уровне значимости Р < 0,01 для соответствующих субгрупп диффузной и местной форм, а также отличие между всеми субгруппами разлитой и местной форм.
Для LBP (табл. 2) было установлено достоверное повышение по сравнению с контролем в обеих субгруппах разлитой формы (Р < 0,01), грамотрицательной (Р < 0,01), грамположительной (Р < 0,05) и смешанной (Р < 0,05) субгруппах диффузной формы и грамотрицательной субгруппе местной формы (Р < 0,01). При местной форме грамотрицательной субгруппы значение LBP было достоверно выше (Р < 0,01), чем в других субгруппах этой формы. Грамотрицательные, грамположительные и смешанные субгруппы диффузной и местной форм различались с достоверностью соответственно Р < 0,05, Р < 0,01 и Р < 0,01. Субгруппы разлитой и местной форм различались на уровне значимости Р < 0,01.
При анализе последнего показателя, sCD14 (табл. 2), было выявлено, что во всех субгруппах, за исключением грамположительной и смешанной при местной форме, произошло его повышение с достоверностью Р < 0,01. Для всех форм перитонита характерно то, что максимальное повышение этого показателя установлено в грамотрицательных субгруппах, а минимальное — в грамположительных, причем показатели всех субгрупп в пределах соответствующей формы отличались на уровне значимости Р < 0,01.
Межсубгрупповой анализ для sCD14 позволил установить, что субгруппы разлитой формы отличаются от соответствующих субгрупп диффузной и местной форм на уровне Р < 0,01. Кроме того, грамположительная и смешанная субгруппы диффузной формы отличаются от соответствующих субгрупп местной формы также на уровне Р < 0,01.
Обобщая результаты, приведенные в табл. 2, можно прийти к заключению, что при грамотрицательной инфекции у детей с перитонитом наблюдаются резкое снижение анти-ЭТ-IgG и повышение анти-ЭТ-IgМ, анти-ЭТ-IgА, LBP и sCD14 по сравнению с грамположительной и смешанной инфекцией. Следует заметить, что установленная нами зависимость тяжести перитонита от степени дисрегуляции антиэндотоксинового иммунитета наиболее характерна для грамотрицательной флоры.
Несомненно, полученные результаты, которые согласуются с литературными данными [4, 8], раскрывают совершенно новые патогенетические связи антиэндотоксинового иммунитета, с одной стороны, с тяжестью течения, с другой — в анализе с различными типами возбудителя.

Выводы
1. Перитонит у детей приводит к дисрегуляции в системе антиэндотоксинового иммунитета, которая проявляется в угнетении специфического звена (резкое снижение высокоаффинных анти-ЭТ-IgG) и активации неспецифических компонентов (повышение уровня LBP и sCD14) с наибольшей степенью выраженности для разлитой формы перитонита.
2. Установленная зависимость тяжести перитонита от степени дисрегуляции антиэндотоксинового иммунитета наиболее характерна для грамотрицательной флоры, при которой наблюдается резкое снижение уровня анти-ЭТ-IgG и повышение анти-ЭТ-IgМ, анти-ЭТ-IgА, LBP и sCD14 по сравнению с грамположительной и смешанной инфекцией.
Перспективы дальнейших исследований. С учетом полученных данных о роли антиэндотоксинового иммунитета у больных с перитонитом планируется изучение иммунокоррекции у данной категории в зависимости от стадийности септического процесса и патогенетических механизмов ответа организма на эндотоксин грам­отрицательной флоры.


Bibliography

1. Баиров Г.А. Срочная хирургия детей: Руководство для врачей. — СПб., 1997. — 462 с.
2. Федоров К.К. Первичный перитонит у детей // Бюллетень сибирской медицины. — 2004. — № 2. — С. 47-56.
3. Пастернак І.І., Боднар Б.М., Безруков Л.О., Бро­жик В.Л., Боднар О.Б., Шестобуз С.В. Сучасна оцінка імунологічних показників у дітей з гострим деструктивним апендицитом, ускладненим поширеними формами перитоніту // Буковинський медичний вісник. — 2000. — Т. 4, № 1–2. — С. 85-87.
4. Bierhaus A., Chen J., Liliensiek B., Nawroth P.P. LPS and cytokine-activated endothelium // Semin. Thromb. Hemost. — 2000. — Vol. 26, № 5. — P. 571-587.
5. Chen G., Li J., Ochani M., Rendon-Mitchell B., Qiang X. et al. Bacterial endotoxin stimulates macrophages to release HMGB1 partly through CD14- and TNF-dependent mechanisms // J. Leukoc. Biol. — 2004. — Vol. 76, № 5. — P. 994-1001.
6. Gioannini T.L., Teghanemt A., Zarember K.A., Weiss J.P. Regulation of interactions of endotoxin with host cells // J. Endotoxin Res. — 2003. — Vol. 9, № 6. — P. 401-408.
7. Van Bossuyt H., De Zanger R.B., Wisse E. Cellular and subcellular distribution of injected lipopolysaccharide in rat liver and its inactivation by bile salts // J. Hepatol. — 1988. — Vol. 7. — P. 325-337.
8. Weiss J. Bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) and lipopolysaccharide-binding protein (LBP): structure, function and regulation in host defence against Gram-negative bacteria // Biochem. Soc. Trans. — 2003. — Vol. 31(Pt. 4). — P. 785-90.
9. Гордієнко А.І., Білоглазов В.О. Патент 70193 А Україна, МКІ 7 А61К31/01. Спосіб визначення антитіл до діполісахаридів грамнегативних бактерій; Заявл. 29.12.2003; Опубл. 15.09.2004, Бюл. № 9.
10. Гордиенко Ан.И., Белоглазов В.А., Гордиенко Ал.И. Микротурбидиметрический метод определения IgG, IgM, IgA человека // Iмунологiя та алергологiя. — 2000. — № 1. — С. 12-15.
11. Tiirola T., Jaakkola A., Bloigu A., Paldanius M., Sinisalo J., Nieminen M.S., Silvennoinen-Kassinen S., Saikku P., Jauhiainen M., Leinonen M. Novel enzyme immunoassay utilizing lipopolysaccharide-binding protein as a capture molecule for the measurement of chlamydial lipopolysaccharide in serum // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. — 2006. — Vol. 54(1). — P. 7-12.
12. Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях. — К.: Морион, 2000. — 319 с. 


Back to issue