Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.


Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.

"Child`s Health" 3(18) 2009

Back to issue

Система «протеїназа — інгібітор протеїназ» у дітей із початковою стадією хронічного захворювання нирок

Authors: Макєєва Н.І., Сенаторова Г.С. Харківський національний медичний університет Самохіна Л.М. Державна установа «Інститут терапії імені Л.Т. Малої АМН України», м. Харків

Categories: Pediatrics/Neonatology

print version


Summary

Досліджені активність нейтральних протеїназ, нетрипсиноподібних протеїназ, трипсинінгібіторна активність α1-інгібітору протеїназ і α2-макроглобуліну в сироватці крові й сечі дітей із початковою стадією хронічного захворювання нирок до лікування. Показано, що система «протеїназа — інгібітор протеїназ» відіграє істотну роль при хронічному захворюванні нирок і проявляється в пригніченні протеолізу на фоні активації інгібіторів протеїназ як у сироватці крові, так і в сечі. Зазначений баланс «протеїназа — інгібітор» допомагає зберігати ниркові клітини в умовах патологічного процесу в нирках, а також створює умови для накопичення екстрацелюлярного матриксу.


Keywords

система «протеїназа — інгібітор протеїназ», хронічне захворювання нирок, діти.

У людини клінічні й лабораторні ознаки хронічної ниркової недостатності (ХНН) з’являються лише тоді, коли залишається менш ніж 50 % працюючих нефронів. Функціональних резервів однієї нирки і навіть половини працюючої вистачить для забезпечення екскреторної функції завдяки значній гіпертрофії працездатних нефронів. Тому ознаки ураження нирок залишаються тривалий час не визначеними [1]. Обгрунтуванням включення осіб із нормальною швидкістю клубочкової фільтрації (ШКФ) у групу хронічного захворювання нирок (ХЗН) є часта маніфестація значних ушкоджень нирок ще до зниження цього ключового показника ниркових функцій, а також те, що ці пацієнти мають підвищений ризик несприятливого результату ХЗН [2]. Стає зрозумілим, що відсутність зниження ШКФ у пацієнтів із ХЗН не виключає наявності прогресуючої нефропатії. Тому триває пошук більш чутливих, тонких маркерів подальшого ураження клітин та поступового зниження функції нирки [3]. Досягнення клітинної та молекулярної біології останніх років сприяли просуванню в розумінні та вивченні провідних патофізіо­логічних механізмів прогресування ХЗН. Незалежно від типу первинного ураження нирки зазнають адаптивних гемодинамічних, біохімічних, клітинних та молекулярних змін, що характеризується акумуляцією депозитів екстрацелюлярного матриксу (ЕМ) та призводить до ремоделювання тубулоінтерстиціальної тканини з можливим переходом у нефросклероз [4, 5]. Кількість ЕМ в інтерстиції визначається співвідношенням між продукцією та руйнуванням білків протеазами. Фіброз інтерстицію може бути наслідком зменшення активності протеїназ, можливо, завдяки порушенню балансу «протеїназа — інгібітор» [6]. Регуляція активності протеїназ, зокрема нетрипсиноподібних протеїназ (НТПП) — хімази, частково тоніну, в організмі відбувається за участю інгібіторів протеїназ, а саме a1-інгібітору протеїназ (a1-ІП) та a2-макроглобуліну (a2-МГ).
Мета дослідження — зробити аналіз участі протеїназ, НТПП та окремих інгібіторів протеїназ при формуванні ХЗН у дітей.

Матеріали та методи
Було обстежено 30 дітей, з них до 1-ї групи були включені 22 дитини (14 хлопчиків, 8 дівчаток; середній вік 12,8 ± 0,6 року) з ХЗН 1-ї стадії (ШКФ > 90 мл/хв)
і різною нефрологічною патологією (хронічний гломерулонефрит, спадковий нефрит, хронічний обструктивний пієлонефрит на фоні уродженої аномалії органів сечовивідних шляхів). Під час дослідження всі пацієнти мали ремісію або неповну ремісію основ­ного захворювання. У цієї групи дітей ризик прогресування ХЗН у бік ХНН був великим. Усі хворі мали перманентну мікроальбумінурію або протеїнурію, у них був відсутній функціональний нирковий резерв, що є клінічним еквівалентом внутрішньоклубочкової гіпертензії. До 2-ї (контрольної) групи увійшли 8 здорових дітей, порівнянних за віком і статтю.
Досліджували активність нейтральних протеїназ, НТПП, трипсинінгібіторну активність a1-ІП і активність a2-МГ у сироватці крові й сечі хворих до лікування. Активність указаних протеїназ і їх інгібіторів визначали з використанням високочутливого (10–9–10–10 г) ферментативного методу [7]. Принцип ферментативного методу заснований на використанні як субстрату протеолітичної реакції іммобілізованого на поверхні полі­стиролу маркерного ферменту (пероксидаза хрону), що наперед був кон’югований із субстратним білком. Для визначення активності протеїназ, НТПП, трипсинінгібіторної активності a1-ІП як субстрату використовували альбумін сироватки бика (БСА). Для визначення НТПП окремо проводили реакцію пригнічення ферментів, таких як трипсин, плазмін, сироватковий калікреїн, а також тоніну (має і трипсин-, і хімотрипсинподібну активність) доданням 1 : 1 за об’ємом соєвого інгібітору трипсину (СІТ) у концентрації 0,01 мкг/мл й інкубували 5 хв при 37 °С. Потім проводили реакцію розщеплення іммобілізованого комплексу маркерного ферменту і БСА. Для визначення рівня a2-МГ як субстрат протеолітичної реакції використовували протамінсульфат. Після проведення реакції утворення комплексу «протеїназа — інгібітор протеїназ» до реакційної суміші додавали 1 : 1 за об’ємом СІТ у концентрації 150 мкг/мл й інкубували 5 хв при 37 °С для зв’язування вільних протеїназ. Рівень a2-МГ у досліджених зразках розраховували за залишковою активністю трипсину, зв’язаного з a2-МГ. Протеолітичну реакцію розщеплення іммобілізованого комплексу проводили шляхом інкубації реакційної суміші при 37 °С протягом 15 хв. Після цього видаляли продукти реакції відмиванням і визначали оптичну щільність маркерного ферменту за допомогою імуноферментного фотометра-аналізатора Humareader, Human (Німеччина).


Оцінку рівня зазначених показників проводили після протеолітичної реакції за залишковою активністю маркерного ферменту, розраховували в г/л/год та мг/л/год в сироватці крові та сечі відповідно. В експериментах використовували СІТ виробництва Reanal (Угорщина), пероксидазу хрону, апротинін фірми ICN (США), трипсин фірми Spofa (Чехія), БСА, протамінсульфат, полістиролові плашки стрипові (Росія).
Статистичну обробку отриманих даних проводили за допомогою статистичного пакету програми Statistica 7.0. Під час оцінки відмінностей середніх для ознак з нормальним розподілом використовували критерій Стьюдента; для ознак, розподіл яких відзначався від нормального, — критерії Манна — Уїтні та Краскела — Уоліса. Результати вважалися статистично вірогідними при значеннях p < 0,05.

Результати та їх обговорення
Результати дослідження подані в табл. 1, 2. У сироватці крові дітей із ХЗН 1-ї стадії відзначене вірогідне зменшення загальної активності протеїназ і активності НТПП, підвищення рівня a2-МГ порівняно з конт­ролем. Трипсинінгібіторна активність a1-ІП суттєво не відрізнялася від показників у здорових дітей (табл. 1).
У сечі виявили вірогідне зниження загальної активності нейтральних протеїназ та зростання рівня a2-МГ порівняно з контролем (табл. 2).
Узагалі відзначено односпрямований характер змін (зниження активності протеїназ і підвищення активності інгібіторів) у сироватці крові й сечі порівняно з контролем.
Пригнічення протеолізу на фоні підвищеної активності a2-МГ у сироватці крові за відсутності змін ­активності a1-ІП можна пояснити тим, що a1-ІП залучається до пригнічення активності протеолітичних ферментів на фоні витрачення ресурсів a2-МГ, інгібітору I, тобто інгібітору, який першим включається в реакції комплексоутворення з протеїназами порівняно з a1-ІП [8]. Виявлений характер змін активності інгібіторів у сироватці крові може обумовлювати зміни їх рівня в сечі: підвищення a2-МГ і відсутність змін активності a1-ІП порівняно з контролем. Даний характер змін інгібіторів протеїназ сприяє пригніченню протеолізу, особливо за участю трипсиноподібних ферментів.
Проведення додаткового кореляційного аналізу дозволило відзначити позитивний зв’язок (r = +0,406; r = +0,610) між активністю нейтральних протеїназ та їх інгібіторів у сироватці крові й відсутність кореляції між активністю НТПП та інгібіторів, що вказує на природну захищеність організму від активації проте­- олізу (рис. 1).
У сечі нами відзначено позитивний корелятивний зв’язок між активністю протеїназ (r = +0,325); НТПП (r = +0,320) та a2-МГ, що може свідчити про достатню участь даного інгібітору в пригніченні як трипсиноподібних ферментів, так і НТПП (хімаза, частково тонін) у нирках (рис. 2).


Позитивний кореляційний зв’язок між активністю a1-ІП у сироватці крові та сечі (r = +0,397) та менш виражений відносно a2-МГ (r = +0,182) може свідчити про залучення саме a2-МГ до пригнічення протеолізу, а роль a1-ІП менш значна (рис. 3).
Цей факт також ілюструється наявністю позитивного кореляційного зв’язку між активністю протеїназ у сироватці крові та a1-ІП у сечі (r = +0,301), a2-МГ у сироватці крові та a1-ІП в сечі (r = +0,429), а також негативного кореляційного зв’язку між активністю протеїназ у сироватці крові та a2-МГ у сечі (r = –0,319). Тобто на 1-й стадії ХЗН a2-МГ пригнічує протеоліз переважно без необхідності залучення a1-ІП, що узгоджується з даними літератури [8]. a2-МГ може гальмувати апоптогенні механізми стосовно матричних протеїнів, що, у свою чергу, також сприяє експансії екстрацелюлярного матриксу [6, 9].
Після зіставлення даних літератури й отриманих результатів дослідження механізм ініціації хронічного захворювання нирок можна уявити так. Внутрішньоклубочкова гіпертензія, протеїнурія ушкоджують тубулярні клітини. Наявність високого рівня a2-МГ в сироватці крові й сечі підтверджує цей факт, демонструючи «немотивоване скидання» інгібітору з сечею. Зафіксоване в обстежених пацієнтів пригнічення протеолізу можна вважати позитивним моментом у цьому випадку, спрямованим на запобігання руйнування тубулярних клітин. Ушкоджені клітини вивільняють цитокіни та фактори росту. Ці медіатори стимулюють заохочення клітин в інтерстицій (макрофаги, Т-лімфоцити, фібробласти та ін.). Деякі з цих клітин змінюють свій фенотип та продукують екстрацелюлярні матричні білки. Інгібітори протеїназ попереджають руйнацію матричних протеїнів, що ілюструється високим рівнем a2-МГ і a1-ІП у сироватці крові і як наслідок — у сечі. Це сприяє накопиченню естрацелюлярного матриксу. Тобто низька активність протеїназ і високий рівень їх інгібіторів у дітей мають двоїстий ефект. З одного боку, такий баланс «протеїназа — інгібітор» допомагає зберігати ниркові клітини, а з іншого — створює умови для експансії екстрацелюлярного матриксу, що поглиблює гіпоксію тубулярних клітин. Відомо, що кількість екстрацелюлярного матриксу в інтерстиції визначається співвідношенням між продукцією та руйнуванням білків протеазами. Тому в дітей із ХЗН фіброз інтерстицію може бути наслідком зменшення активності протеїназ, можливо, через порушення балансу «протеїназа — інгібітор».
Висновки
1. Система «протеїназа — інгібітор протеїназ» відіграє істотну роль у розвитку ХЗН у дітей і полягає в пригніченні протеолізу за участю a2-МГ.
2. Низька активність протеїназ і високий рівень їх інгібіторів у дітей із початковою стадією ХЗН мають двоїстий ефект: з одного боку, такий баланс «протеїназа — інгібітор» допомагає зберігати ниркові клітини в умовах патологічного процесу в нирках, а з іншого — створює умови для накопичення екстрацелюлярного матриксу.

Перспективи подальших досліджень
Дослідження системи «протеїназа — інгібітор протеїназ» на різних стадіях ХЗН та компонентів, що регулюють процес прогресування, можуть спрямувати подальше вивчення стосовно нових підходів до діагностики (сечова екскреція цитокінів і факторів росту) та лікування хронічного захворювання нирок.

 


Bibliography

1. Дудар І., Величко М. Ренопротекція: реальні можливості сьогодення // Ліки України. — 2004. — № 7–8, 9.
2. Пиріг Л.А., Іванов Д.Д., Таран О.І. та ін. Хронічна ниркова недостатність. — К.: Аврора-плюс, 2004. — 96 с.
3. Смирнов А.В., Есаян А.М., Каюков И.Г. Хроническая болезнь почек: на пути к единству представлений // Нефрология. — 2002. — № 4. — С. 11-17.
4. Ремузи Д., Бертани Т. Патофизиология прогрессирующих нефропатий (обзор) // Международный медицинский журнал. — 2000. — № 2. — С. 78-85.
5. Kobori H., Nangaku M., Navar L.G., Nishiyama A. The intrarenal renin-angiotensin system: from physiology to the pathobiology of hypertension and kidney disease // Pharmacol. Rev. — 2007. — V. 59, № 3. — P. 251-287.
6. Peltier J., Bellocq A., Perez J. et al. Calpain activation and secretion promote glomerular injury in experimental glomerulonephritis: evidence from calpastatin-transgenic mice // J. Am. Soc. Nephrol. — 2006. — V. 17, № 12. — P. 3415-3423.
7. Самохина Л.М., Дубинин А.А. Способ определения активности протеиназ или их ингибиторов в биологических жидкостях // МПК G 01 № 33/48, С 12 Q 1/38; Заявка № 4654144 от 22.02.89 г. — Патент России № 1655991 от 20.01.94 г.
8. Веремеенко К.Н., Голобородько О.П., Кизим А.И. Проте­олиз в норме и при патологии. — Київ: Здоров’я, 1988. — 198 с.
9. Веремеенко К.Н., Досенко В.Е., Нагибин В.С. и др. Протеолитические ферменты и апоптоз // Укр. біохім. журн. — 2003. — Т. 75, № 6. — С. 10-24.


Back to issue