Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.

"Actual Infectology" 4(13) 2016

Back to issue

Biological material for microslides to diagnose human infectious and parasitic diseases

Authors: Аракельян Р.С.(1), Стулова М.В.(1), Карпенко С.Ф.(1), Гасанова Э.Д.(2), Окунская Е.И.(3), Герасина Н.И.(4), Адайбаева В.Ж.(5), Кузина А.Ю.(6)
(1) — ФГБОУ ВО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Астрахань, Россия
(2) — ГБУЗ АО «Областная инфекционная клиническая больница им. А.М. Ничоги», г. Астрахань, Россия
(3) — ГБУЗ АО «Детская городская поликлиника № 3», г. Астрахань, Россия
(4) — ГБУЗ АО «Центр медицины катастроф и скорой медицинской помощи», г. Астрахань, Россия
(5) — ГБУЗ АО «Александро-Мариинская областная клиническая больница», г. Астрахань, Россия
(6) — ГБУЗ АО «Областная детская клиническая больница им. Н.Н. Силищевой», г. Астрахань, Россия

Categories: Infectious diseases

Sections: Specialist manual

print version


Summary

Матеріалом для мікроскопічного дослідження були кров, кістковий мозок, ліквор, пунктати лімфатичних вузлів, фекалії, дуоденальний вміст і жовч, сеча, харкотиння, виділення сечостатевих шляхів, біоптати тканин, мазки зі слизової оболонки ротової порожнини, піднебінних мигдалин, носа та ін. Остаточний діагноз гельмінтозів може бути встановлений тільки на підставі позитивних даних лабораторних досліджень. Основним методом лабораторної діагностики цих інвазій є виявлення яєць або личинок гельмінтів. Матеріалом для досліджень служать випорожнення, вміст дванадцятипалої кишки, кров, харкотиння, біопсовані тканини та інші матеріали. Препарати з крові для мікроскопії готують зазвичай на предметному склі, від його якості і чистоти значною мірою залежить ефективність виявлення та ідентифікації кровепаразитів. Препарати від хворих на лейшманіоз досліджують під імерсією, лейшманії в них розташовуються поза клітинами, але нерідко вони виявляються в цитоплазмі мононуклеарів і нейтрофільних лейкоцитів. Число лейшманій в одній клітині може досягати декількох десятків. Вони мають форму дрібних овальних або круглих тілець розміром від 2,5 до 5 мкм. Цитоплазма забарвлюється в сірувато-блакитний, ядро — у червоний або червоно-фіолетовий, кінетопласт — у темно-фіолетовий колір. Наявність ядра і кінетопласт — голов­на ознака, що відрізняє лейшманію від тромбоцитів, коків, дріжджових клітин. При лабораторному дослідженні (забарвлення за Романовським — Гімзою) мікрофілярії фарбуються в темно-блакитний колір і нагадують покручені волокна. Усередині личинок добре проглядається ядерна зернистість. Збудники паразитарних і інфекційних хвороб також можуть перебувати й в інших біологічних субстанціях організму людини (сеча, спинномозкова рідина, кістковий мозок, виділення сечостатевих органів, дуоденальний вміст, жовч, мокротиння).

Материалом для микроскопического исследования являлись кровь, костный мозг, ликвор, пунктаты лимфатических узлов, фекалии, дуоденальное содержимое и желчь, моча, мокрота, отделяемое мочеполовых путей, биоптаты тканей, мазки со слизистой оболочки ротовой полости, небных миндалин, носа и др. Окончательный диагноз гельминтозов может быть установлен только на основании положительных данных лабораторных исследований. Основным методом лабораторной диагностики этих инвазий является обнаружение яиц или личинок гельминтов. Материалом для исследований служат испражнения, содержимое двенадцатиперстной кишки, кровь, мокрота, биопсированные ткани и другие материалы. Препараты из крови для микроскопии готовят обычно на предметных стеклах, от их качества и чистоты в огромной степени зависит эффективность обнаружения и идентификации кровепаразитов. Препараты от больных лейшманиозом исследуют под иммерсией, лейшмании в них располагаются вне клеток, но нередко они обнаруживаются в цитоплазме мононуклеаров и нейтрофильных лейкоцитов. Число лейшманий в одной клетке может достигать нескольких десятков. Они имеют форму мелких овальных или круглых телец размером от 2,5 до 5 мкм. Цитоплазма окрашивается в серовато-голубой, ядро — в красный или красно-фиолетовый, кинетопласт — в темно-фиолетовый цвет. Наличие ядра и кинетопластов — главный признак, отличающий лейшманию от тромбоцитов, кокков, дрожжевых клеток. При лабораторном исследовании (окраска по Романовскому — Гимзе) микрофилярии окрашиваются в темно-голубой цвет и напоминают извитые волокна. Внутри личинок хорошо про­сматривается ядерная зернистость. Возбудители паразитарных и инфекционных болезней также могут находиться и в других биологических субстанциях организма человека (моча, спинномозговая жидкость, костный мозг, отделяемое мочеполовых органов, дуоденальное содержимое, желчь, мокрота).

The material for microscopic examination were blood, bone marrow, cerebrospinal fluid, lymph node puncture, feces, duodenal contents and bile, urine, sputum, urogenital tract secretions, tissue biopsies, smears from the mucous membranes of the mouth, tonsils, nose, etc. The final diagnosis of helminth infections can be established only on the basis of the positive findings of laboratory research. The basic method of laboratory diagnosis of these invasions is the detection of helminth eggs or larvae. The material for the research is the feces, the contents of the duodenum, blood, sputum, tissue biopsies, and other materials. Slides of blood microscopy are usually prepared on glass slides, their quality and purity greatly impact the effectiveness of detection and identification of blood parasites. The material from leishmaniasis patients is studied under immersion; Leishmania locate mainly outside the cell, but often they are found in the cytoplasm of mononuclear cells and neutrophils. The number of Leishmania in a single cell can reach several tens. They are in the form of small round or oval cells ranging in size from 2.5 to 5 microns. The cytoplasm is gray-blue co­lored, the nucleus are red or red-purple, kinetoplasts are dark purple color. The presence of a nucleus and kinetoplasts is the main feature that distinguishes Leishmania from platelets, cocci, and yeast cells. In a laboratory study (painting by Romanovsky — ­Giemsa), microfilaria are colored in dark blue and resemble crimped fibers. Inside the larvae nuclear grain is easy visible. The causative agents of parasitic and infectious diseases can also be found in other biological substances of the human body: the urine, cerebrospinal fluid, bone marrow, secretion of urinary organs, duodenal contents, bile, and phlegm.


Keywords

інфекційні захворювання; паразитарні захворювання; діагностика; біологічний матеріал

инфекционные заболевания; паразитарные заболевания; диагностика; биологический материал

infectious diseases; parasitic diseases; diagnosis; biological material

Статью опубликовано на с. 22-26
 
Инфекционные и паразитарные болезни на протяжении многих столетий были и остаются наиболее опасными болезнями человеческого организма из-за их способности вовлечь в процесс большое число здоровых людей в течение короткого периода времени.
Инфекционные и паразитарные заболевания относятся к числу наиболее распространенных недугов человека. Характеризуясь различным по степени тяжести течением, большинство из них при правильном и свое–временном лечении способно заканчиваться полным выздоровлением, так как лекарственные препараты действуют непосредственно на причину болезни — микроорганизм. В этой связи качество и оперативность диагностики инфекций приобретают особое значение [4]. 
Лабораторные исследования играют важную роль в установлении диагноза инфекционных и паразитарных болезней, при назначении этиотропной терапии, проведении контроля за эффективностью лечения. Процесс специфической лабораторной диагностики основан на выявлении возбудителя и ответной реакции организма человека в ходе инфекционного процесса. Он состоит из трех этапов: сбора материала, транспортировки и его исследования в лаборатории. К проведению каждого этапа предъявляют определенные требования, от соблюдения которых зависит эффективность лабораторной диагностики. Задача врача заключается в правильном выборе метода исследования и грамотной оценке его результатов [4].
Материалом для микроскопического исследования являлись кровь, костный мозг, ликвор, пунктаты лимфатических узлов, фекалии, дуоденальное содержимое и желчь, моча, мокрота, отделяемое мочеполовых путей, биоптаты тканей, мазки со слизистой оболочки ротовой полости, небных миндалин, носа и др. 
Для обнаружения кровепаразитов, например простейших (малярийные плазмодии, трипаносомы, лейшмании, бабезии) и гельминтов (микрофилярии), исследуют препараты «тонкий мазок» и/или «толстая капля» крови [4].
Спинномозговую жидкость [4] для микробиологического исследования отбирают в стерильную пробирку во время люмбальной пункции. Для приготовления препарата используется осадок, образующийся спонтанно или в результате центрифугирования.
Мочу [4] для микроскопического исследования собирают в стерильную посуду после тщательного туалета наружных половых органов. Для приготовления препарата используют осадок мочи.
Микроскопическому исследованию подвергаются нативные (нефиксированные, неокрашенные) и окрашенные препараты. В первом случае выявляются живые микроорганизмы в препарате «висячая капля» или «раздавленная капля», оцениваются подвижность и морфологические свойства возбудителя. 
Наиболее широко применяется микроскопия микроорганизмов в окрашенном состоянии, в частности для диагностики паразитарных болезней (малярия, амебиаз, лямблиоз, лейшманиоз, гельминтозы). Для окраски препаратов используют ориентировочные, специальные и дифференцирующие методы. Ориентировочная окраска позволяет оценить общую морфологию микроорганизма. С этой целью применяют стандартные красители — фуксин или метиленовый синий [2].
Окончательный диагноз гельминтозов может быть установлен только на основании положительных данных лабораторных исследований. Основным методом лабораторной диагностики этих инвазий является обнаружение яиц или личинок гельминтов [4].
Материалом для исследований служат испражнения, содержимое двенадцатиперстной кишки, кровь, мокрота, биопсированные ткани и другие материалы.
Сбор материала для исследования производят в чистую стеклянную или пластмассовую посуду, на которую наклеивают этикетку с указанием необходимых сведений. При массовом обследовании допускается сбор фекалий в стаканчики из парафинированной бумаги и пр.
Испражнения для анализов должны доставляться в лабораторию не позднее одних суток после их выделения, а при подозрении на стронгилоидоз — немедленно. При невозможности доставить фекалии в указанные сроки их следует смешивать с 2–5-кратным количеством консервирующих жидкостей и хранить до исследования в охлажденном виде.
Кровь — жидкая ткань организма, в компонентах которой могут паразитировать простейшие (малярийные плазмодии, трипаносомы, лейшмании, бабезии) и гельминты (филярии, шистосомы). Для некоторых из них кровь является основным местом обитания, и они составляют группу кровепаразитов. Таковы малярийные плазмодии, бабезии, которые паразитируют в эритроцитах, и трипаносомы, обитающие в плазме крови. Лейшмании и токсоплазмы обитают в тканевых макрофагах и в кровеносном русле появляются редко. Что касается гельминтов, то взрослые шистосомы постоянно живут в венозных сосудах, отрождая здесь яйца. Другие гельминты — филярии основным местом локализации выбирают лимфатические сосуды, а личинки (микрофилярии), которые они отрождают, проникают в плазму и длительное время в ней сохраняются [1, 3].
Для обнаружения кровепаразитов исследуют цельную кровь, приготавливая из нее тонкий мазок и толстую каплю. Эти препараты исследуют в нативном (трипаносомы, микрофилярии тропических гельминтозов) или окрашенном (малярийные плазмодии, лейш–мании, микрофилярии) виде.
Препараты из крови для микроскопии готовят –обычно на предметных стеклах, от их качества и чистоты в огромной степени зависит эффективность обнаружения и идентификации кровепаразитов.
Для лабораторного подтверждения диагноза малярии из крови больного готовят тонкий мазок и толстую каплю, в которой вероятность обнаружения возбудителя большая (одно поле зрения толстой капли соответствует 50 полям тонкого мазка). Для идентификации возбудителя исследуется и мазок.
При изготовлении мазков палец поворачивают проколом вверх. К выступившей капле крови прикасаются нижней поверхностью предметного стекла, отступив на 1,5–2 см от узкого края. Затем стекло переворачивают, берут в левую руку, а в правую — предметное стекло со шлифовальными краями и обломанными уголками и его узким краем под углом в 45° касаются капли крови. Кровь растекается по краю шлифованного стекла. Мазок должен быть тонким (эритроциты не должны налегать друг на друга). Затем мазок высушивают на воздухе, фиксируют 15 мин в 96° этиловом спирте или 20 мин в смеси Никифорова (в равных соотношениях этиловый спирт и эфир). Фиксированные мазки высушивают на воздухе и окрашивают 30–45 мин по методу Романовского — Гимзе. В мазке крови плазмодии обнаруживаются в эритроцитах, причем цитоплазма паразитов окрашивается в голубой или серовато-синий цвет, а ядро — в различные оттенки красного цвета. В цитоплазме плазмодия на стадии собственного шизонта появляется пигмент — мелкие зернышки коричневого или темно-коричневого цвета. Тонкий мазок крови содержит фиксированные эритроциты, располагающиеся в один слой. Находящиеся в эритроцитах плазмодии хорошо визуализируются, что дает возможность правильно установить вид возбудителя и стадию его развития [3].
При изготовлении толстых капель палец поворачивают проколом вниз. К выступающим каплям крови подносят предметное стекло, на которое берут 2–3 капли крови и затем углом другого предметного стекла кровь размазывают, чтобы получить на стекле овал диаметром около 1 см или полосу длиной 2–3 см. Слой крови не должен быть слишком толстым. Затем мазок сушат на воздухе, можно в термостате (30–35 °С). После высушивания окрашивают в течение 40–45 мин по Романовскому — Гимзе без предварительной фиксации. При этом происходит выщелачивание гемоглобина из эритроцитов, и одновременно окрашиваются лейкоциты, кровяные пластинки и плазмодии. Это повышает чувствительность метода, так как позволяет просматривать более толстый слой крови. Малярийные плазмодии в толстой капле выглядят иначе, чем в мазке, потому что в нефиксированном виде плазмодии подвергаются деформации и лежат в поле зрения свободно, паразиты уменьшаются в размерах. Окрашиваются плазмодии в толстой капле так же, как и в мазке.
Толстую каплю готовят следующим образом. На предметное стекло наносят 2–3 капли крови и размазывают ее до диаметра десятикопеечной монеты. Кровь подсушивают на воздухе, затем к ней добавляют дистиллированную воду для удаления из эритроцитов гемоглобина, вновь подсушивают, окрашивают по Романовскому — Гимзе на протяжении 45 мин, после чего краску смывают, препараты подсушивают и подвергают микроскопии [1].
Микроскопируя препараты, распознают вид плазмодия. Эритроциты, в которых находятся возбудители трехдневной малярии, увеличены в размерах (в 1,5 раза), бледнее окрашены по сравнению с эритроцитами, свободными от плазмодиев. В пораженных плазмодиями эритроцитах появляется нежная, равномерно красного цвета зернистость, распределяющаяся по всему эритроциту (шюффнеровская зернистость). Шизонт амебовидной формы, стадия морулы имеет вид тутовой ягоды. Эритроциты, которые содержат возбудителей четырехдневной малярии, в размерах не увеличиваются. В первые 10 ч паразит имеет форму кольца, меньших размеров, чем возбудитель трехдневной малярии, затем шизонт принимает форму ленты, расположенной поперек эритроцита. В этой стадии паразит занимает 1/0–1/3 объема эритроцита, ядро лежит на краю ленты. Стадия морулы имеет форму розетки и включает 6–8–10 мерозоитов. Пигмент золотисто-желтого цвета [1].
Морфология четырех видов малярийных паразитов человека достаточно специфична, чтобы их можно было идентифицировать в мазках крови. Инфицированные Р.vivax эритроциты увеличены в размере, бледно-окрашенные, содержат диффузно расположенные ярко-красные пятнышки (зерна Шюффнера); форма и размеры паразитов при этом могут быть самыми разнообразными; при малярии инфицированные эритроциты имеют овальную форму, в остальном они похожи на эритроциты, пораженные возбудителями трехдневной малярии (Р.vivax). Размер эритроцитов, инфицированных возбудителем четырехдневной малярии (Р.malariae), не изменен, они не содержат зернистости. Паразиты часто принимают лентовидную форму, причем мерозоиты располагаются в виде розетки вокруг находящегося в центре пигмента; возбудители тропической малярии кольцевидной формы, очень мелкие, содержат одно или, чаще, два комочка хроматина, распластаны, как правило, по краю эритроцита. В мазках периферической крови обнаруживаются только кольцевидные стадии бесполых форм паразита, причем могут встречаться случаи присутствия в одном эритроците нескольких микроорганизмов. Гамонты отличаются более крупными размерами, имеют банановидную форму. При уровне паразитов выше 2 % есть все основания предполагать наличие тропической малярии [3]. 
Форма и размеры эритроцитов при тропической малярии не изменяются. В периферической крови взрослые шизонты и формы их деления не встречаются, так как эти стадии происходят в кровеносных капиллярах внутренних органов, мозга пристеночно. Это самый мелкий паразит из всех возбудителей малярии. В стадии деления он не занимает диаметра эритроцита. В периферической крови можно обнаружить юные шизонты в виде колец, по 2–4 в одном эритроците, и половые клетки. В эритроцитах с паразитами появляется грубая зернистость в виде пятен неправильной формы пурпурно-красного цвета (мауреровская пятнистость). Диагноз ставится на основании обнаружения в периферической крови юных шизонтов (по 2–3 в одном эритроците) или взрослых гаметоцитов, которые имеют вид полулуния либо сигары. Ядро в этих клетках расположено посередине и окружено зернами пигмента черно-коричневого цвета.
Лейшмании. Это группа жгутиковых простейших, вызывающих различные формы лейшманиозов. В крови обычно обнаруживаются только висцероподобные лейшмании, возбудители висцеральных лейш–маниозов [4].
Препараты от больных лейшманиозом исследуют под иммерсией, лейшмании в них располагаются вне клеток, но нередко они обнаруживаются в цитоплазме мононуклеаров и нейтрофильных лейкоцитов. Число лейшманий в одной клетке может достигать нескольких десятков. Они имеют форму мелких овальных или круглых телец размером от 2,5 до 5 мкм. Цитоплазма окрашивается в серовато-голубой, ядро — в красный или красно-фиолетовый, кинетопласт — в темно-фиолетовый цвет. Наличие ядра и кинетопластов — главный признак, отличающий лейшманию от тромбоцитов, кокков, дрожжевых клеток.
Микрофилярии. Большая группа тропических гельминтозов — филярий, вызывающих у человека 8 нозоформ филяриадозов, взрослые паразиты обитают в органах и тканях и недоступны для идентификации. Их личинки (микрофилярии) концентрируются в крови или коже [4].
При лабораторном исследовании (окраска по Романовскому — Гимзе) микрофилярии окрашиваются в темно-голубой цвет и напоминают извитые волокна. Внутри личинок хорошо просматривается ядерная зернистость.
Исследование кала. Деревянной палочкой или спичкой из разных мест доставленной пробы берут комочек кала величиной со спичечную головку и тщательно растирают его на предметном стекле с несколькими каплями 50% раствора глицерина до получения полупрозрачного и равномерного мазка, который занимает почти всю поверхность предметного стекла. Грубые кусочки непереваренной клетчатки удаляют. Обычно мазки просматриваются при малом увеличении микроскопа (7 × 8) без покровного стекла. В правильно приготовленном нативном мазке яйца глистов обычно хорошо видны под малым увеличением микроскопа. 
Фекалии — самый обильный и сложный по составу экскрет человеческого организма. В нем при лабораторном исследовании могут быть обнаружены практически все гельминты и патогенные кишечные простейшие, идентификация которых не вызывает особых трудностей у грамотного специалиста. 
Возбудители паразитарных и инфекционных болезней также могут находиться и в других биологических субстанциях организма человека: моча, спинномозговая жидкость, костный мозг, отделяемое мочеполовых органов, дуоденальное содержимое, желчь, мокрота.
 
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии какого-либо конфликта интересов при подготовке данной статьи.

Bibliography

1. Беляев А.Е., Званцов А.Б., Авдюхина Т.И. Практическое руководство по эпидемиологическому надзору для стран Европейского региона, столкнувшихся с возвратом малярии. — Копенгаген, 2006. — С. 22-25.
2. Лысенко А.Я., Горбунова Ю.П., Авдюхина Т.И., Константинова Т.Н. Лабораторная диагностика кишечных прото–зоозов. Учебное пособие. — М., 2004. — 44 с.
3. Лысенко А.Я., Кондрашин А.В., Ежов М.Н. Маляриология. ВОЗ. — Копенгаген, 2003. — С. 213-225.
4. Лысенко А.Я., Красильников А.А. Лабораторные методы диагностики паразитарных болезней. — М., 1999. — 61 с.

Similar articles

Эпидемиологические аспекты малярии у детей в Астраханском регионе
Authors: Окунская Е.И.(1), Адайбаева В.Ж.(2), Маштеев А.Б.(3), Стулова М.В.(4), Глебова И.В.(2), Арчакова Т.И.(4), Ксендзова А.А.(4), Назарова А.И.(4), Курьянова О.В.(4), Илларионова О.С.(4), Сологубова С.В.(4)
(1) — ГБУЗ АО «Детская городская поликлиника № 3», г. Астрахань, Россия
(2) — ГБУЗ АО «Александро-Мариинская областная клиническая больница», г. Астрахань, Россия
(3) — ГБУЗ АО «Центр медицины катастроф и станции скорой медицинской помощи», г. Астрахань, Россия
(4) — ФГБОУ ВО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Астрахань, Россия

"Actual Infectology" Том 5, №1, 2017
Date: 2017.04.21
Categories: Infectious diseases
Sections: Clinical researches
Authors: Щелкун А.В., Самсон А.А., Шавлов Н.М., Белорусская медицинская академия последипломного образования; Юровский Н.Н., Щерба В.В., Рогачева Т.А., Минская городская инфекционная клиническая больница, Республика Беларусь
"Emergency medicine" 1(20) 2009
Date: 2009.04.30
Categories: Family medicine/Therapy, Medicine of emergency
Педиатрические аспекты малярии
Authors: Кириленко В.А., Кириленко Т.В. - Винницкий национальный медицинский университет им. Н.И. Пирогова
"Child`s Health" 7 (50) 2013
Date: 2013.12.10
Categories: Family medicine/Therapy, Infectious diseases, Pediatrics/Neonatology
Sections: Specialist manual
Дирофиляриоз в Астраханской области: современное состояние проблемы
Authors: Аракельян Р.С., Галимзянов Х.М., Аракельян А.С. — ГБОУ ВПО «Астраханский государственный медицинский университет»; ГБУЗ АО «Александро-Мариинская областная клиническая больница», г. Астрахань, Россия
"Actual Infectology" 4 (5) 2014
Date: 2015.02.09
Categories: Infectious diseases
Sections: Specialist manual

Back to issue